【摘 要】
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目的:验证和比较目前所发现的所有天然功能性第2类整合酶的活性,确定第2类整合酶催化基因盒剪切和整合的关键氨基酸位点,通过亲和层析的方法纯化第2类整合酶蛋白,为进一步实验提供基础,最终为明确整合子捕获耐药性基因盒的反应和调控机制提供线索。方法:以第2类整合子作为研究对象,通过在线数据库INTEGRALL(http://integrall.bio.ua.pt)对有关第2类整合子的数据进行筛查、统计、整
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目的:验证和比较目前所发现的所有天然功能性第2类整合酶的活性,确定第2类整合酶催化基因盒剪切和整合的关键氨基酸位点,通过亲和层析的方法纯化第2类整合酶蛋白,为进一步实验提供基础,最终为明确整合子捕获耐药性基因盒的反应和调控机制提供线索。方法:以第2类整合子作为研究对象,通过在线数据库INTEGRALL(http://integrall.bio.ua.pt)对有关第2类整合子的数据进行筛查、统计、整理和分析,对找到的天然功能性第2类整合酶基因进行质粒构建--通过定点突变的方法构建可在IPTG诱导下高表达第2类整合酶蛋白的质粒。构建含基因盒sat2和attI2-dfrA14片段的重组质粒pACIa,建立实时荧光定量PCR检测第2类整合酶介导基因盒sat2剪切与整合效率的体系。运用实时荧光定量PCR的方法检测和比较天然功能性第2类整合酶蛋白的重组活性。以本课题组首次发现的变形杆菌47437基因组为模板,通过随机突变试剂对基因组中的功能性第2类整合酶基因进行随机突变从而构建第2类整合酶突变文库,运用实时荧光定量PCR的方法检测突变后第2类整合酶介导基因盒剪切与整合效率的变化,确定第2类整合酶催化基因盒剪切和整合的关键氨基酸位点。最后通过构建麦芽糖及功能性第2类整合酶融合蛋白并对其进行诱导、表达和纯化,为下一步的研究提供实验基础。结果:在线数据库INTEGRALL中总共筛查到236条有关第2类整合子的数据,通过整理分析,总共找到5种不同的天然功能性第2类整合子,成功构建可以表达5种功能性第2类整合酶蛋白的质粒pINTI2P(IntI2A176_V256)、pINTI2E(IntI2)、pINTI2F(IntI2A176)、pINTI2V(IntI2S175_A176)、pINTI2W(IntI2C172_T174_A176)以及提供基因盒sat2和整合位点attI2的质粒pACIa,并成功构建实时荧光定量PCR检测第2类整合酶介导基因盒sat2剪切与整合效率的体系。实时荧光定量PCR检测和比较5种功能性第2类整合酶蛋白的重组活性,结果显示活性无显著性差异,其中活性最高的IntI2A176约为活性最低的IntI2s175_A176的2倍。以变形杆菌47437基因组为模板,通过随机突变功能性第2类整合酶基因,总共构建了 2000个突变文库,实时荧光定量PCR检测突变后整合酶介导基因盒剪切与整合效率的变化,发现 T23N、F34S、L73I、V111E、L129P、L134S、R135H、I154N、F272L、T274R、R284S、G291W和Y301C位点的改变可以引起第2类整合酶活性的丧失。通过基因克隆构建了可以表达融合蛋白MBP-IntI2的重组质粒pMAL-IntI2、pMAL-IntI2T274R、pMAL-IntI2T297P、pMAL-IntI2V144D、pMAL-IntI2Y208F,成功纯化出蛋白 MBP-IntI2、MBP-IntI2T274R、MBP-IntI2T297P、MBP-IntI2Y208F。结论:5个天然功能性第2类整合酶的编码氨基酸序列多态性限制在172、174、175、176和256位氨基酸上,提示功能性第2类整合子具有较低的遗传多态性;通过验证确定 T23、F34、L73、V111、L129、L134、R135、1154、F272、T274、R284、G291和Y301为第2类整合酶催化基因盒剪切和整合的关键氨基酸位点;成功纯化的功能性第2类整合酶蛋白为下一步的研究提供基础;最终为明确功能性第2类整合子捕获耐药性基因盒的作用机制提供理论依据。图[20]表[5]参[45]
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