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肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,Cpn)是一种重要的非典型病原体,常可引起肺炎、支气管炎等呼吸系统疾病,也有研究表明其与心内膜炎、反应性关节炎等肺外疾病密切相关。肺炎衣原体感染宿主细胞后,主要依靠包涵体提供生存环境和所需营养,逃避宿主免疫。包涵体膜蛋白作为包涵体的重要组成部分,承担着重要的生物学功能,引起研究者高度关注。Cpn0308是已经实验研究证实的包涵体膜蛋白,但其生物学功能还有待进一步研究。前期实验运用酵母双杂交技术初步筛选出了与Cpn0308相互作用的分子为乙酰辅酶A结合域蛋白3(Acyl-coenzyme A binding domain-containing 3,ACBD3),本研究利用免疫共沉淀技术、GST pull-down技术和亚细胞共定位技术对两者间的相互作用做进一步鉴定。首先,以He La细胞c DNA为模板,根据前期酵母双杂交实验所得配体基因序列设计引物,通过PCR方法扩增ACBD3基因片段,与pc DNA3.1+/Flag载体质粒经双酶切和T4连接酶连接,构建真核表达载体pc DNA3.1+/Flag-ACBD3,并利用菌落PCR、双酶切及质粒测序的方法进行质粒筛选鉴定。然后,采用免疫共沉淀技术,验证Cpn0308与ACBD3间的相互作用。利用脂质体转染的方法,将实验室保存的pc DNA3.1/Myc-HisCpn0308和新构建的pc DNA3.1+/Flag-ACBD3两种质粒共转染至He La细胞,培养48h后收集细胞,离心裂解后加入Myc beads翻转吸附过夜,通过western blot技术进行检测,结果显示在33.5k D和15k D处有两条条带,分别对应为ACBD3和Cpn0308蛋白,证明两种蛋白间存在相互作用。同时,利用GST pull-down技术,分别制备诱饵蛋白GST-Cpn0308和猎物蛋白ACBD3,经诱饵蛋白固定、猎物蛋白捕获、洗涤等步骤后,通过western blot检测,发现实验组存在39k D和33.5k D两条条带,分别对应了GST-Cpn0308蛋白和ACBD3蛋白,进一步确认了两种蛋白间的相互作用。最后,利用亚细胞共定位技术,将pc DNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pc DNA3.1+/Flag-ACBD3质粒共转染至He La细胞,培养24h后进行丙酮固定,以兔抗Myc抗体和鼠抗Flag抗体作为一抗,羊抗鼠Ig G-Cy3抗体、羊抗兔Ig G-FITC抗体作为二抗,对表达的融合蛋白Myc-Cpn0308和Flag-ACBD3进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察,发现Cpn0308显绿色荧光,ACBD3显红色荧光,两者融合显黄色荧光,确认外源性的两种蛋白间存在相互作用。基于同样的方法,将pc DNA3.1/Myc-His-Cpn0308转染至He La细胞,利用鼠抗Cpn0308抗体和兔抗ACBD3抗体作为一抗,羊抗小鼠Ig G-Cy3抗体、羊抗兔Ig G-FITC抗体作为二抗,进行免疫荧光染色实验,发现Cpn0308显红色荧光,ACBD3显绿色荧光,两者融合显黄色荧光,对Cpn0308蛋白和内源性ACBD3间的相互作用进行了鉴定。综合以上实验结果,证实了肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308与ACBD3存在相互作用,为Cpn0308的生物学功能研究提供了依据,并可能有助于对肺炎衣原体生长发育的分子机制的进一步研究。