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目的：建立DNA结合染料(SYBR Green Ⅰ)实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测人端粒酶亚单位hTERT mRNA表达的方法，检测膀胱移行细胞癌患者尿液脱落细胞端粒酶亚单位hTERT mRNA表达，研究DNA结合染料(SYBR Green Ⅰ)实时荧光定量RT-PCR检测人端粒酶亚单位hTERT mRNA表达在膀胱移行细胞癌(Transitional cell carcinoma)临床实验诊断中的应用，为更灵敏、更特异的分子肿瘤标志物的临床应用提供理论依据。方法：1. 培养端粒酶阳性表达的T24人膀胱移行细胞癌细胞株和端粒酶阴性表达的IMR90人成纤维细胞株。2. 建立DNA结合染料(SYBR Green Ⅰ)实时荧光定量RT-PCR检测人端粒酶亚单位hTERT mRNA表达的方法，定量检测T24和IMR90细胞株端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达。3. 应用半定量非竞争RT-PCR(semi quantitative noncompetitive RT-PCR)检测T24和IMR90细胞株端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达。4. 应用实时荧光定量RT-PCR，定量检测26例膀胱移行细胞癌患者、12例良性泌尿系统疾病患者和6例正常人尿液中脱落细胞端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达。结果：1. 随着DNA结合染料SYBR Green Ⅰ浓度升高和温度转变速度(temperature transition rate)的增快，实时荧光定量RT-PCR解链曲线(melting curve)向更高的Tm值迁移；解链曲线出现两个峰，低Tm值的峰为非特异<WP=9>性的PCR产物峰，高Tm值的峰为特异性的PCR产物峰，GAPDH和hTERT非特异性PCR产物Tm值分别为72.8℃和71.6℃，GAPDH和hTERT特异性PCR产物Tm值分别为87.2℃和90.5℃；热启动PCR非特异性产物峰低于非热启动PCR。2. 应用不同稀释倍数GAPDH和hTERT标准品，GAPDH和hTERT实时荧光定量RT-PCR标准曲线回归方程分别为：Ct=25.77－2.27log[GAPDH (copies)] (r=－1.000)，Ct =37.22－3.06log[hTERT (copies)] (r=－1.000)；应用不同稀释倍数的cDNA，GAPDH和hTERT实时荧光定量RT-PCR回归方程分别为：Ct=10.46－3.98log[cDNA (μl)] (r=－1.000)，Ct=25.996－2.075log[cDNA (μl)] (r=－1.000)；对GAPDH和hTERT标准品不同拷贝数进行3次重复扩增，批内平均精密度(CV%)分别为2.82%和1.59%；hTERT和GACDH的扩增效率比较，斜率为0.0068。3. 实时荧光定量RT-PCR检测IMR90和T24细胞株hTERT mRNA的表达，IMR90细胞株无表达，T24细胞株表达为25.06[100×hTERT(copies)／GAPDH(copies)]。4. 半定量非竞争RT-PCR检测IMR90和T24细胞株hTERT mRNA的表达，IMR90细胞株hTERT mRNA无表达，T24细胞株hTERT mRNA表达为0.06[hTERT(IOD)／GAPDH(IOD)]。5. 应用实时荧光定量RT-PCR，定量检测26例膀胱移行细胞癌患者尿液中脱落细胞hTERT mRNA表达，其中20例呈阳性表达，12例泌尿道良性疾病患者和6例正常人都为阴性表达，实时荧光定量RT-PCR用于膀胱移行细胞癌的诊断特异度为100%，诊断敏感度为76.9%，诊断正确率86.4%；hTERT mRNA阳性表达率与膀胱移行细胞癌不同病理分级(P<0.01)和临床分期(P<0.01)显著相关；hTERT mRNA的表达量与膀胱移行细胞癌不同病理分级(P<0.01)和临床分期(P<0.05)显著相关；尿液脱落细胞中hTERT mRNA的表达量可用于判别病理分级和临床分期的预报，预报的准确率分别为：Grade Ⅰ为100％(3／3)，Grade Ⅱ为72.7％(8／11)，Grade Ⅲ为83.3％(5／6)，浅表性膀胱癌(Ta-T1)为100％(4／4)，侵润性膀胱癌(T2-T3)<WP=10>为56.3％(9／16)。结论：1. DNA结合染料(SYBR Green Ⅰ)实时荧光定量RT-PCR通过解链曲线分析，能分辨特异性扩增产物和非特异性扩增产物，解链曲线分析和热启动PCR的使用可提高PCR扩增反应的特异性。2. DNA结合染料(SYBR Green Ⅰ)实时荧光定量RT-PCR检测端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达灵敏度高和动态范围宽，实时监测PCR扩增反应，保证PCR扩增反应在指数扩增期内进行，核酸定量准确、快速，重复性好，不需电泳等PCR结束后的产物分析工作。3. 半定量非竞争RT -PCR检测端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达，动态范围窄，扩增反应易偏离指数扩增期，定量需凝胶电泳分析，操作繁琐，为核酸半定量的方法。4. 实时荧光定量RT-PCR检测尿液中端粒酶亚单位hTERT mRNA的表达，对膀胱移行细胞癌的诊断有高灵敏度、特异性和诊断正确率的优点。尿液脱落细胞hTERT mRNA的表达量可用于膀胱癌患者的病理分级和临床分期的判定。此诊断方法为非侵入诊断，病人无痛苦，对膀胱移行细胞癌早期诊断、预后和随访有重要的意义。