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目的:研究大鼠发生急性胰腺炎时,与凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)在胰腺组织的表达及其与caspase-1和IL-1β的关系;研究ASC在巨噬细胞系P388D1细胞中的表达情况,为评价ASC在大鼠急性胰腺炎时的作用机制提供实验依据。
方法:(1)将20只健康、成年的SD大鼠随机分成两组,一组用5%去氧胆酸钠逆行注入大鼠胰胆管进行急性胰腺炎造模,另一组作为正常对照组。造模24小时后处死大鼠,取大鼠新鲜血清,通过全自动生化分析仪检测大鼠血清淀粉酶活性;用ELISA法测定血清IL-1β含量。取大鼠胰腺组织经脱水、透明、浸蜡、包埋,做成蜡块后连续切片,用免疫组化LAB法检测ASC和caspase-1在胰腺组织中的表达,将染色的切片置于Olympus多功能显微镜观察并摄像,应用CA6300彩色图像分析系统进行定量灰度扫描,求出给定面积内的灰度值,比较急性胰腺炎组和正常对照组间ASC和caspase-1两项指标表达的差异。(2)制备感受态的DH5α大肠杆菌,将带有绿色和红色荧光的质粒pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-C1分别转染大肠杆菌表达,培养细菌进行质粒的扩增,应用大连宝生物公司生产的试剂盒、采用SDS碱裂解法提取和纯化质粒。(3)复苏巨噬细胞系P388D1细胞,加入1640培养液约10ml混匀,分装至两个无菌培养瓶中,37℃,5%CO<,2>培养箱中培养48小时。从培养瓶中取出300μ1细胞液加到24孔培养板中汇片,置37℃,5%CO<,2>培养箱中培养24小时。在倒置显微镜下观察,当细胞覆盖至小孔底部一半时使用大连宝生物公司生产的转染试剂盒将纯化的pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-Cl质粒分别转染至该细胞中继续培养24小时,最后涂片后进行荧光拍照,观察质粒在P388D1细胞中的表达情况。
结果:(1)急性胰腺炎组血清淀粉酶水平(77632±5934nknt/L)较正常对照组水平(16303±1450nkat/L)显著升高,两者间的差异在统计学上有意义(p<0.01);急性胰腺炎组IL-1β水平(386.26±50.54ng/L)较正常对照组水平(99.11±18.43ng/L)显著升高,两者间的差异在统计学上有意义(p<0.01)。(2)免疫组化检测、分析发现:ASC和caspase-1在正常对照组大鼠胰腺组织中少量表达,在急性胰腺炎组表达显著增加,两组间灰度值(24.86±523vs54.12±7.91和35.46±4.21vs65.32±8.10)的差异在统计学上均有意义(p<0.01)。(3)在巨噬细胞系P388D1细胞中ASC寡聚成斑点样。
结论:本实验证明了当发生胰腺炎时,单核-巨噬细胞系统激活,在胰腺组织的巨噬细胞中ASC的表达上调,发生寡聚并调节caspase-1的活化,导致IL-1β的分泌增加,引起炎症反应,从而证明ASC在胰腺炎的发病中起重要作用。