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本研究将氧氟沙星(ofloxacin,OFL)和二氟沙星(difloxacin,DIF)分别与两种载体蛋白偶联合成了四种人工抗原。用合成的免疫原免疫长耳白兔,制备出高效价的抗OFL血清、抗DIF血清与混免血清(抗OFL和DIF血清)。分别以抗OFL血清和混免血清为核心建立了检测氧氟沙星的间接竞争酶联免疫吸附测定法(Ci-ELISA法);并分别以抗DIF血清和混免血清为核心建立了检测二氟沙星的Ci-ELISA法。1.二氟沙星和氧氟沙星人工抗原的合成及鉴定采用碳二亚胺法,将氧氟沙星分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,同样将二氟沙星分别与BSA和OVA偶联,制备出四种人工抗原OFL-BSA、OFL-OVA、DIF-BSA和DIF-OVA。由FeCl3显色反应结果可知:彻底透析的人工抗原溶液与FeCl3反应后出现不同程度的橙黄色且略显浑浊,透析外液、BSA溶液和OVA溶液则呈现浅黄色,说明透析内液中存在大量连接在载体蛋白上的二氟沙星或氧氟沙星,由此可初步推断二氟沙星和氧氟沙星与载体蛋白BSA和OVA的交联成功。紫外扫描图谱显示人工抗原的最大吸收峰即不同于载体,也不同于半抗原,另外人工抗原的紫外扫描图谱还显示有半抗原的特征性吸收峰出现,进一步说明交联反应成功。用紫外光谱法计算出OFL-BSA、OFL-OVA、DIF-BSA和DIF-OVA的半抗原结合比分别是11.16:1、5.90:1、5.47:1和6.40:1。2.抗体制备与ELISA工作浓度的测定用人工合成的免疫抗原DIF-BSA、OFL-BSA及其混合物(1:1)分别免疫长耳白兔,制备出了三种抗血清:抗DIF血清、抗OFL血清、混免血清(抗DIF和OFL血清)。抗OFL血清和抗DIF血清的效价均为1:29×104;混免血清用OFL-OVA包被时效价为1:29×104,用DIF-OVA包被时效价为1:28×104。用抗OFL血清和混免血清分别建立检测OFL的Ci-ELISA法时,包被抗原(OFL-OVA)的工作浓度分别为2μg/ml和0.25μg/ml,抗OFL血清和混免血清的工作浓度均为1:4×105。用抗DIF血清和混免血清分别建立检测DIF的Ci-ELISA法时,包被抗原(DIF-OVA)的工作浓度分别为0.25μg/ml和1μg/ml,抗DIF血清和混免血清的工作浓度分别为1:2×105和1:4×105。3.间接竞争酶联免疫吸附测定法(Ci-ELISA法)的建立用抗OFL血清和混免血清分别建立了OFL的Ci-ELISA标准曲线。OFL抑制抗OFL血清的标准曲线的线性回归方程为y=-0.2044x+0.961(r=0.9927),半数抑制量( IC50 ) =180.32ng/ml ,最低检测限( LOD ) =0.85ng/ml ,线性范围为0.85~10000ng/ml ; OFL抑制混免血清的标准曲线的线性回归方程为y=-0.1984x+0.9687(r=0.9885),IC50=231.57 ng/ml, LOD=1.62ng/ml,线性范围为1.62~10000ng/ml。另外还用抗DIF血清和混免血清分别建立了DIF的Ci-ELISA标准曲线, DIF抑制抗DIF血清的标准曲线的线性回归方程为y=-0.223x+0.9631(r=0.9929),IC50=119.21ng/m l,LOD=1.14ng/ml,线性范围为1.14~10000ng/ml ; DIF抑制混免血清的标准曲线的线性回归方程为y=-0.1738x+0.915(r=0.9985),IC50=245.32ng/ml,LOD=1.86 ng/ml,线性范围为1.86~10000ng/ml。由以上结果可知,研究建立的标准曲线在各自的线性范围内线性关系良好;建立的Ci-ELISA方法的灵敏度达到目前对OFL或DIF的检测要求。本研究用三种血清建立的检测方法的批内CV均在7%以内,批间CV均在15%以内,符合方法所需的精密度要求。交叉反应性实验结果表明:制备的抗体与选择的氟喹诺酮类药物都有一定的交叉反应,与磺胺嘧啶、氯霉素、土霉素和阿莫西林无交叉反应(交叉反应率<0.01%)。由牛奶中添加回收实验的结果可知,当添加的DIF或OFL的浓度在15~10000ng/ml时,所建立方法的添加回收率都在71.70%~92.85%之间,符合ELISA方法对添加回收率的要求,说明建立的方法用于测定牛奶中的OFL或DIF的残留时应有很好的准确度。