中华鳖(Pelodiscrus sinensis),俗称甲鱼,是我国传统的淡水养殖品种。近几年来,由于养殖密度增加、养殖环境日益恶劣,中华鳖在养殖过程中遭受了各类病原微生物的侵害。这些病原微生物往往能引起养殖物种的大量死亡,给养殖户造成巨大的经济损失,威胁水产养殖业的可持续发展。目前主要采用化学药物防治疾病,而化学药物的不规范使用会带来较大的食品安全隐患,并危害生态环境。免疫防治作为一种更加安全环保的防控手段,开始逐渐成为研究热点。肠道是动物重要的免疫器官,是机体抵抗外源微生物的第一道防线。研究中华鳖的肠道粘膜免疫系统,有助于更好地了解中华鳖的免疫防御机制,并为制作口服纳米疫苗提供理论基础。研究中我们采用组织学、分子生物学以及转录组学的方法系统研究了中华鳖肠道粘膜免疫系统,确定了肠道主要的免疫细胞,揭示了肠道对外源刺激物产生免疫应答的的分子机制,分析了参与粘膜免疫的重要蛋白多聚免疫球蛋白受体的免疫应答反应,并在以上免疫机理的基础上,研制了一种运载病原菌外膜蛋白的纳米口服疫苗,并检测了其对中华鳖的免疫应答反应。具体研究结果如下:1.中华鳖肠道粘膜免疫相关细胞的形态学观察和研究利用透射电子显微镜观察了中华鳖肠道横切面,发现肠道存在着大量的上皮内淋巴细胞和杯状细胞。将外源温和气单胞菌和LPS诱导中华鳖,利用HE染色和PAS染色方法分别观察和统计肠道绒毛上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数目变化,结果发现该两种免疫细胞数目在肠道前段、中段和后段,均表现为先上升后下降的趋势,且在48 h数目达到最大值,显著高于生理盐水对照组(P<0.05)。同时我们还利用荧光定量PCR技术来检测外源诱导物LPS和温和气单胞菌对肠道免疫球蛋白IgM和IgD的基因表达的影响,结果发现IgM基因表达量上升,而IgD基因的表达量变化不明显。2.转录组学方法研究中华鳖肠道粘膜免疫机制利用组织切片及转录组学技术深入分析外源LPS诱导中华鳖肠道的免疫应答机制。结果显示,LPS刺激48h后,肠道的免疫相关细胞杯状细胞和上皮内淋巴细胞数目显著上升,说明外源LPS引起了肠道免疫应答。利用转录组学技术,发现外源LPS诱导组和生理盐水对照组之间存在着748个差异表达基因,包括361个表达量上调的基因和387个表达量下调的基因,其中有48个基因被鉴定与免疫相关,这些基因属于82个GO terms和14个途径。3.中华鳖pIgR基因的克隆及其对外源刺激的免疫应答通过氨基酸结构以及同源性分析,发现中华鳖pIgR基因能够编码591个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为65.7 kDa和7.38,包含有胞外区、跨膜区以及胞内区,其中胞外区包括了四个结构域;pIgR与其他爬行动物的同源性较高,鸟类、哺乳类和两栖类次之,而与鱼类的同源性最低。通过荧光定量PCR,显示pIgR基因在各组织器官中的表达量从高到低依次为:小肠、食道、大肠、肝脏、心脏、肌肉、脾脏、胃和肾脏;在胚胎发育过程中,该基因的表达量呈现一个先上升后下降的趋势,在孵化31 d时达到最大值。受到外源刺激物温和气单胞菌和LPS诱导后,pIgRmRNA的表达量在食道、胃、小肠和大肠中均有显著上调后又逐渐恢复正常水平的变化趋势。Western blotting和免疫组化结果显示,pIgR蛋白在肠上皮细胞细胞质中表达,且小肠组织pIgR蛋白表达会随着LPS诱导上调,说明该蛋白在中华鳖粘膜免疫中具有重要作用。4.中华鳖口服纳米疫苗及免疫效果的研究利用离子交换法制备得到一种羧甲基壳聚糖纳米颗粒,羧甲基壳聚糖和CaC12的最佳配比为:0.5mg/mL与2mg/mL,制备得到的纳米颗粒平均粒径为229.07±4.28nm,多分散系数PDI仅为0.070±0.02,颗粒粒径小、分散性好、颗粒均一,具有较好的安全性、稳定性以及对肠道的通透性。从嗜水气单胞菌中提取主要蛋白大小为43 kDa和38 kDa的外膜蛋白,利用羧甲基壳聚糖纳米粒包埋该蛋白制备得到一种纳米口服疫苗,以生理盐水、羧甲基壳聚糖纳米粒以及外膜蛋白作为对照,通过组织化学和荧光定量PCR技术来检验口服纳米疫苗的免疫效果,结果发现纳米疫苗的免疫效果高于外膜蛋白和羧甲基壳聚糖,且二次强化免疫也能引起机体肠道的免疫反应。