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小反刍兽疫(PPR)又称山羊瘟、口腔炎-肺炎综合征等,是家养和野生小反刍动物的重要传染性病毒疾病,其病原是副粘病毒科,麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV)。目前,该病依然呈现不断蔓延之势,造成了巨大的经济损失。信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)是PPRV感染宿主的主要天然受体,PPRV通过其血凝素蛋白(H)与宿主SLAM受体结合,使病毒附着并侵入宿主细胞,将SLAM蛋白导入细胞中稳定表达可以提高细胞对PPRV的敏感性。有研究表明,SLAM受体N端V结构域通过与H蛋白结合启动麻疹病毒的入侵感染,PPRV与麻疹病毒同属于麻疹病毒科。本研究利用慢病毒表达系统建立稳定表达山羊SLAM/V的Vero细胞系,提高细胞对PPRV的敏感性用于PPRV田间毒的分离。本文研究工作如下:1.采用山羊外周血淋巴细胞的总RNA以RT-PCR方法获得SLAM/V基因,将其插入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功表达出包含SLAM/V蛋白与GST标签的融合蛋白,其分子质量约为39 kDa,主要以包涵体形式存在。Western-blot试验证实,纯化后的融合蛋白与山羊抗人SLAM多克隆抗体具有良好的反应活性。2.构建了嵌合有外源基因SLAM/V的真核表达载体pEGFP/SLAM/V,转染Vero细胞后24h、36h、48h均可见细胞发出荧光,表明SLAM/V区基因可以通过pEGFP/SLAM/V载体转染Vero细胞进行表达,且转染后36 h目的基因表达量最高。Western-blot试验证明,Vero细胞中表达的SLAM/V功能域蛋白具有活性。3.通过同源重组法构建出了嵌合有SLAM/V基因的表达载体pDEST/SLAM/V,通过与pLP1载体、pLP2载体和pLP/VSVG载体共转染293FT细胞,收获包装有SLAM/V基因的无复制能力的慢病毒。再用该慢病毒感染Vero细胞,以2.5μg/mL杀稻瘟菌素S进行转基因阳性细胞抗性筛选。对以倍比稀释法筛选出的阳性亚克隆细胞进行PCR扩增鉴定,再将筛选鉴定出的亚克隆株细胞与Vero细胞以β-actin蛋白作为对照进行Western-blot鉴定,两种细胞活力一致,亚克隆细胞表达SLAM/V蛋白。将筛选出的亚克隆细胞与Vero进行间接免疫荧光鉴定,单层的转基因细胞发出明显的绿色荧光,Vero细胞无荧光,证明SLAM/V基因被整合入亚克隆Vero/SLAM/V细胞中表达。4.分别制作Vero/SLAM/V细胞与Vero细胞的细胞生长曲线,Vero细胞比Vero/SLAM/V细胞生长略快,但最终都能达到一个数量级。通过对Vero/SLAM/V细胞与Vero细胞拍照观察,两种细胞形态差异不大,Vero/SLAM/V细胞长轴略短于Vero细胞。传50代后仍能PCR扩增出预期大小的外源基因,表明SLAM/V基因被正确整合到Vero/SLAM/V细胞的基因组上并能稳定遗传。5.Vero/SLAM/V细胞与Vero细胞均接种PPRV Nig/75/1疫苗株病毒,接种第二天即可观察到细胞病变,且Vero/SLAM/V细胞出现的合胞体更大更多,病毒感染后特征性病变比较明显;传毒3代以后,Vero/SLAM/V细胞病变收毒的时间明显缩短。real-time RT-PCR法分析不同样品中病毒的相对拷贝数,其中Vero/SLAM/V细胞培养物中病毒的相对拷贝数能增加约100倍,证明SLAM/V蛋白具有明显增强PPRV复制的性能。本试验成功构建出了SLAM/V基因转染阳性亚克隆Vero细胞株。