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磷脂酶A2（PLA2）是蛇毒中的重要毒素,具有神经毒、肌肉毒、血液毒性等,并可以引起严重的炎症反应。蛇血清中存在蛇毒PLA2天然抑制蛋白（PLA2inhibitor,PLI）,可以保护蛇机体免于中毒。其中γ型PLI是分布最广、报道最多的PLI。PLIγ在有毒蛇和无毒蛇中均有表达,但不同的蛇源PLIγ抗毒活性有较大的差异,具体原因尚不清楚。目前研究报道的PLIγ仅停留在从蛇血液中分离纯化以及活性的证明上,对结构的研究不多。本文以两种高活性的华游蛇PLIγ（SaPLIγ）和王锦蛇的PLIγ（EcPLIγ）为亲本,采取DNA改组的方法,将两种PLIγ进行基因重组,利用噬菌体表面展示技术淘选高活性的改组PLIγ。目的:通过基因改组的定向进化策略和噬菌体表面展示技术,对PLIγ进行改组并筛选获得更高活性的PLIγ,探讨关键氨基酸序列、局部结构与PLIγ活性的关系。方法:（1）取新鲜的华游蛇、王锦蛇肝脏,提取RNA,逆转录获得cDNA,利用简并引物进行PCR扩增,得到两种亲本PLIγ基因,并测序。（2）将SaPLIγ与EcPLIγ基因混合,加入0.05U DNase I酶,16℃水解5min,得到随机长度的DNA片段。酶切产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳,用试剂盒回收50-100bp的片段。PLIγ酶解片段经无引物PCR进行基因重排,然后利用分别含Not I和Sfi I酶切位点的PLIγ引物进行PCR扩增,获得嵌合体PLIγ（cPLIγs）库。将cPLIγs与pCANTAB5e噬菌粒载体分别用Not I和Sfi I进行酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌TG1感受态细胞,获得cPLIγ文库。cPLIγ细菌文库加入M13K07辅助噬菌体进行感染,获得噬菌体库,cPLIγs蛋白表面展示在噬菌体外壳。取400μg的五步蛇粗毒在免疫管中进行包被,加入噬菌体cPLIγ库进行首轮淘选。降低五步蛇毒浓度至200μg/mL,以相同方法包被免疫管和第2轮噬菌体展示淘选,获得高亲和力cPLIγ基因,送公司进行测序。合成分别含Nde I和Xho I位点的PLIγ上下游引物,利用PCR对淘筛的cPLIγ进行克隆。利用基因工程方法把cPLIγ插入pET28c质粒,转入BL21大肠杆菌中表达。优化培养温度和时间,提高cPLIγ可溶性表达量。IPTG诱导表达结束后,收集菌体,冰浴超声破菌,离心后取上清液,取样作SDS-PAGE分析。上清经0.45μm滤膜过滤,上样至镍离子亲和层析柱,经含90mM咪唑的洗脱液洗脱,获得纯化的cPLIγ蛋白。取90μg cPLIγ与30μg五步蛇毒混合,注射昆明小鼠背部皮下,以SaPLIγ和EcPLIγ为对照。6 h后处死小鼠,剥离背部皮肤,用Image-Pro Plus测量出血面积和光密度,评价cPLIγ抗出血毒活性。（4）根据测序结果,翻译出cPLIγ氨基酸序列。用DNAMAN比较cPLIγ和亲本PLIγ序列,检测改组位点。用在线工具PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）分析PLIγs的二级结构。用Swiss-model（http//swissmodel.expasy.org）对cPLIγ和亲本PLIγ进行同源建模,预测三级结构,并用UCSF Chimera软件比较PLIγ的三级结构变化。结合生物信息学的分析,初步的研究PLIγ结构与功能的关系。结果:经过基因克隆、DNA改组、淘筛等步骤,获得了3个与蛇毒PLA2有高亲和性的嵌合PLIγ基因型,分别命名为cPLIγ1（C1）、cPLIγ2（C2）和cPLIγ3（C3）。将高亲和的cPLIγ基因插入pET28c表达质粒,在22℃、210 rpm、0.4 mM IPTG的条件下进行cPLIγ诱导表达,cPLIγ蛋白为可溶性表达。经过Ni柱分离,SDS-PAGE显示为单一条带。三个cPLIγ都对五步蛇粗毒引起的出血毒有较好的抑制作用,其中C2活性最强,并高于两种亲本PLIγ。氨基酸序列及结构分析发现:5个PLIγs基因的相似性达到了91.48%。PLIγ二级结构主要以α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲为主,位置类似。α-螺旋主要在肽链的C端,β-折叠在五个PLIγ中所占比例为31.87%-34.64%,其中华游蛇所占比例最低,C1最高。α-螺旋在C1和C3中都是1.1%,王锦蛇为1.6%,C2为3.28%,华游蛇最高达到了3.3%。C1,C3只有在150-151位形成α-螺旋,EcPLIγ在150-152位置形成α-螺旋,SaPLIγ和C2在150-155为α-螺旋,因此α-螺旋数量和位置也可能影响PLIγ抑制出血活性。结论:成功建立了DNA改组和淘选技术,利用SaPLIγ和EcPLIγ为亲本,获得了3个嵌合体PLIγ。经PET28c大肠杆菌表达,三种cPLIγs都可以抑制五步蛇粗毒引起的出血毒性,其中C2活性高于亲本PLIγ。结构分析表明:85RPFPGLPLSHPNGYI 99可能是PLIγ的有效活性序列。三个cPLIγ二级结构有细微差别,如活性较强的C2与华游蛇PLIγ150-155位是六个氨基酸形成的α-螺旋,而其他PLIγα-螺旋较短。实验室另外发现银环蛇PLIγ150-155位置缺乏α-螺旋结构,而银环蛇PLIγ抗出血毒性不强,这也表明该α-螺旋可能是影响PLIγ活性的重要因素。此外,PLIγ的β-折叠的数量及位置也可能是影响PLIγ抗蛇毒活性的因素。这些生物信息学分析还需要进一步通过实验验证。