研究背景先天性巨结肠(Hirschsprung disease, HSCR)又称肠无神经节细胞症,是一种由肠神经系统发育异常而导致的大肠先天性畸形,其病理特征是肠壁肌间及黏膜下神经丛神经节细胞却如。HSCR为常见的小儿消化道畸形之一,发病率约为1：5000,居消化道畸形的第二位,其在亚洲人群的发病率较高。目前关于先天性巨结肠发病机制的较一致的观点认为：胚胎早期阶段微环境改变及遗传学因素在巨结肠发病中发挥着重要作用,即HSCR由遗传及环境因素共同作用所致。目前,已发现的与先天性巨结肠发病密切相关的基因有许多种,例如RET、GDNF、NRTN、ECE1、EDN3、SOX10、PHOX2B、NRG1等。近年来对HSCR的基因研究有了显著进步,研究者1992年第一次报道了一例10号染色体长臂(10q)中间缺失的全结肠型HSCR患儿,并进一步证实它位于10q11.2和10q21.2之间,最后研究者于1994年证实了先天性巨结肠患儿存在RET基因突变。RET原癌基因在神经嵴细胞中广泛表达,是一种具有络氨酸激酶活性的跨膜受体,对维持肠神经元的发育至关重要,功能实验证实RET基因敲除后可导致鼠全部消化管壁内神经节细胞的缺如,因此,RET基因在先天性巨结肠的发病过程中发挥着重要作用。作为与RET基因互补的GDNF基因也被发现在HSCR患者中存在基因突变。EDNRB的表达伴随胚胎发育的整个过程,它的功能是使神经嵴细胞发育至成熟的神经节细胞,在动物实验中靶向破坏EDNRB基因,可以导致肠管出现无神经节细胞。而与其相应的配体EDN3的基因突变也被证实在HSCR形成过程中发挥着重要的作用,有人报道了66例散发性及9例家族性HSCR病例的EDN3基因检测结果,在外显子2发现了一种新的杂合性突变,这种发生过早的框架移动突变会导致两个区域停止编码,其结果是产生无功能的基因产物。SOX10也被证实是HSCR的易感基因,它在胚胎期表达于神经嵴细胞,参与外周神经系统的形成,检测发现很多HSCR患儿存在SOX10基因突变。上述研究表明,基因在神经嵴干细胞的分化及移行过程中发挥着重要的作用,基因缺陷可明显干扰神经嵴细胞的移行及分化。众所周知,肠神经嵴细胞会快速地迁移至肠管及在肠壁内横向移动,而且,肠神经嵴细胞亚群在肠壁内移行的过程中会进行神经分化,以形成神经丛。肠神经嵴细胞在肠道的定植是神经细胞增殖、迁移及分化过程的完美统一,动物模型中,若神经细胞的数量、迁移行为或者分化比例受干扰时会发生先天性巨结肠。微小RNA (MicroRNAs, miRNA)为由21-25个核苷酸构成的非编码短序列单链RNA分子,是一种内源性小分子RNA, miRNA能够以碱基配对的形式与其靶基因mRNA分子的3’非编码区(3’UTR)发生特异性结合,进而引发mRNA降解或者翻译抑制,最终在转录后水平发挥基因调节作用。迄今,发现了上千种miRNAs,其通过调节ImRNA的表达而在多个生命过程中发挥着重要作用,包括细胞增殖、细胞凋亡、器官发育、应激反应及各种疾病形成等。miRNA对于神经元的发育和正常功能的维持至关重要,miRNA:表达水平的动态变化在神经发生、成熟及大脑的发育过程中发挥着调节作用。缺失Dicer的小鼠会出现大脑发育缺陷一不能发育为正常的神经元形态、神经萎缩、严重的生长缺陷及早期死亡。肠神经系统作为周围神经系统的重要组成部分,其所含的神经元在数量上与脊髓中的含量相当,因此,miRNA可能与肠神经系统的发育也密切相关,而且有研究报道一些miRNAs参与肠神经嵴细胞的分化、增殖、迁移及凋亡整个过程。而且,在发育过程中,miRNA会发挥正性和负性基因转录及转录后调节的协同作用,其结果是导致细胞多样性的产生,而一旦这种协同效应发生障碍,就可能产生先天性发育异常,导致先天性疾病的发生。第一章应用微阵列芯片技术筛选先天性巨结肠组织的miRNA表达谱研究目的应用miRNA微阵列芯片技术检测先天性巨结肠狭窄段与扩张段肠管组织差异表达的miRNAs,初步建立先天性巨结肠组织的miRNA表达谱。方法收集27例在南方医科大学珠江医院行手术治疗的HSCR患儿的狭窄段及扩张段肠管组织,选取其中6例,使用TRIzol (Invitrogen)法提取组织总RNA,并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)纯化提取的RNA。使用NanoDrop ND-1000测量纯化后的RNA浓度,电泳检测RNA完整性。抽提的RNA通过质检后,使用从丹麦Exiqon公司购买的miRCURYTM Array Power Labeling kit对miRNA进行标记,标记完成后,按照Exiqon公司提供的实验方法将样品与miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon)芯片杂交,使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。使用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像,并提取探针的信号值。相同的探针取中值合并。保留在所有样品中均>=30.0的探针,对全部芯片进行中值标准化,筛选差异表达探针。使用Fold change和P-value筛选两组样品间(有重复)的差异表达miRNA。使用Fold change筛选两个样品间(没有重复)的差异表达miRNAs。结果总RNA质量鉴定结果：A260/A280比值均接近2.0,A260/A230比值均大于1.8,表明所有组织标本的总RNA质量可靠,没有降解或其它杂质污染,如DNA、蛋白质等,可进行后续的微阵列芯片等实验。miRNA微阵列芯片筛选结果表明,与扩张段肠管组织相比,狭窄段肠管表达上调超过2倍的miRNAs有19个(miR-3941, miR-K12-1-3p, miR-K12-3-3p, miR-145-3p等),表达下调超过2倍的有7个(miR-625-5p, miR-520g-3p, miR-1260a, miR-3916等)(P均<0.05)。结论先天性巨结肠狭窄段及扩张段肠管组织之间存在显著差异表达的miRNAs,这些显著差异表达的miRNAs可能与先天性巨结肠的发病密切相关,为进一步揭示HSCR的发病机制提供了新的研究思路。第二章差异表达miRNAs的靶基因预测研究目的运用生物信息学软件预测miRNAs靶基因,初步探索miRNA参与先天性巨结肠发生的机制。方法依据Fold Change值、P值及ForeGround值(理想值>100)选择出8个较为理想的miRNAs进行靶基因预测,首先,运用HSCR的主题词于PubMed网站检索,筛选出与HSCR发病相关的基因,然后采用Targetscan、miRTarBase、miRDB、 MicroRNA.org靶基因预测软件分析显著差异表达的miRNAs与先天性巨结肠相关基因之间的关系。结果选择的8个显著差异表达的miRNAs靶基因预测结果表明,除了miR-138-2-3p和miR-148a-3p,其余6个miRNAs与HSCR相关基因存在互补关系。 miR-193a-3p(1个靶基因)、miR-3646(5个靶基因)、miR-1260a(4个靶基因)、miR-4524b-5p(1个靶基因)、miR-145-3p(3个靶基因)、miR-4505(3个靶基因)。结论6个miRNAs与HSCR相关基因存在互补关系,这些miRNAs可能通过这些靶基因参与先天性巨结肠的发病。第三章应用实时荧光定量PCR技术验证先天性巨结肠组织中差异表达的miRNAs研究目的对通过微阵列芯片实验获得的且与HSCR相关基因存在互补关系的差异表达的miRNAs,我们应用实时荧光定量PCR技术做进一步的验证。方法对收集的27例在南方医科大学珠江医院行手术治疗的HSCR患儿的狭窄段及扩张段肠管组织提取总RNA后,我们作进一步qRT-PCR验证。采用SYBR(?)GreenI嵌合荧光法检测miR-145-3p、miR-4505及miR-1260a的表达量。miRNA引物由特异性引物及Oligo(dT)-Universal Tag通用反转录引物构成。按照操作说明书进行RNA的反转录和实时荧光定量PCR反应：(1)2μg含有目的miRNA的总RNA,用miRcutemiRNA First-Strand cDNA Synthesis kit试剂盒在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly (A),再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用反转录引物进行逆转录反应,最终合成miRNA对应的cDNA第一链,反应条件为37℃,60min,95℃,5min,产物-20℃冰箱保存。(2)取2μlmiRNA第一链cDNA液,采用miRcute miRNA qPCR Detection kit(SYBR Green)试剂盒进行miRNA荧光定量检测。PCR反应的条件为：94℃ 2min,1个循环,94℃ 20s,60℃ 34s,45个循环。以U6为内参,进行归一化。结果qRT-PCR证实不同组间miR-145-3p (1.42±0.42,狭窄段vs.0.90±0.31,扩张段)及miR-4505(1.30±0.30,狭窄段vs.0.76±0.22,扩张段)表达量具有统计学差异(P均<0.001),且与HSCR分型有关(P=0.000),而miR-1260a(1.11±0.25,狭窄段vs.0.99±0.21,扩张段)的表达无明显差异(P=0.064)。为了发现其他可能影响狭窄段miRNA表达水平的因素,比较了狭窄段miRNA在年龄、HSCR分型及性别水平上的表达量,结果发现,在1岁以上与1岁以下患儿中,miR-145-3p的相对表达水平无明显差异(P=0.464), miR-4505的相对表达水平也无明显差异(P=0.570)；与短段型相比,长段型患儿miR-145-3p的相对表达水平较高,差异具有统计学意义(P=0.034),另外,长段型患儿miR-4505的相对表达水平也高于短段型患儿,差异具有统计学意义(P=0.000)；在不同性别中,miR-145-3p的相对表达水平无明显差异(P=0.464),而miR-4505的相对表达水平也无明显差别(P=0.766)。结论1. miRNA芯片筛选及实时荧光定量PCR验证结果一致,证实HSCR病变段及扩张段肠管存在miRNAs表达差异,miR-145-3p和miR-4505可能与HSCR的发病密切相关。2. miR-145-3p和miR-4505的表达量与先天性巨结肠患儿的性别和年龄水平无关,但可能与先天性巨结肠的分型密切相关。探讨miR-145-3p和miR-4505的功能及其在HSCR形成过程中的作用将为进一步探讨miRNAs在HSCR形成过程中的作用提供新的思路。