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酿酒酵母作为传统工业酒精酿造菌株，其发酵性能是否优良对企业效益来说尤为关键。为构建一株乙醇高产酿酒酵母，本研究采用代谢工程技术对酿酒酵母乙醇代谢途径进行改造。通过敲除ADHII基因，阻断乙醇分解生成乙醛代谢支路，从而提高酒精产率。本研究以工业酿酒酵母AS2.489为出发菌株，经过产孢和孢子分离，并综合运用生长形态比较法、酵母杂交鉴定法、基因组特异性PCR法、DNA含量比较法和胁迫条件耐受性鉴定法筛选获得3株稳定单倍体菌株，分别为MATa配型AS-5和AS-21菌株，MATα配型AS-7菌株。为敲除ADHII基因，本研究采用LHF-PCR同源重组的方法。首先通过PCR扩增ADHII左侧翼649bp和右侧翼665bp同源序列，构建包含G418抗性与淀粉酶或内切葡聚糖苷酶的基因敲除双功能载体pScIKP-adh2∷egII和pScIKP-adh2∷amy，通过Apa I单酶切转化单倍体菌株W303-1A、AS-7和AS-21，得到5株ADHII敲除的单倍体突变株，同时外源蛋白成功表达。对单倍体出发菌株和突变株进行10g/L葡萄糖常压厌氧发酵实验结果如下：W303-1A菌株在96h乙醇浓度达到最高值，糖醇转化率为78.86%；与AS-7和AS-21菌株在24h乙醇浓度到达最大值相比，糖醇转化率分别为91.19%和92.17%；表明W303-1A菌株发酵性能明显低于本实验室工业酿酒酵母单倍体菌株。比较出发菌株与突变株，发现W303-1A菌株在96h乙醇浓度达到最高时，乙醇浓度和产率分别为3.974g/L和40.3%；而突变株W303-1A-2乙醇浓度为3.949g/L，乙醇产率为39.5%。AS-21菌株发酵24h乙醇浓度达最大值4.699g/L，而突变株AS-21-2需发酵至72h才能达到最大值4.675g/L。与野生菌相比突变株发酵周期推迟，但野生菌株乙醇产率和糖醇转化率分别为47.1%和92.17%，均低于突变株48.5%乙醇产率和94.9%糖醇转化率。而且突变菌株发酵72h至144h乙醇浓度变化小于出发菌株。发酵24h，AS-7菌株乙醇浓度达最大值4.637g/L，其乙醇产率为46.6%，均高于突变株AS-7-2乙醇浓度4.563g/L和45.8%乙醇产率。发酵24h至144h出发菌株与突变株乙醇浓度变化幅度持平。为了研究二倍体突变株发酵特性的变化，本研究将不同配型单倍体野生菌和突变株杂交得到10株二倍体双基因或单基因缺失的突变株。对二倍体出发菌株和突变株进行20g/L葡萄糖常压厌氧发酵实验结果如下：当乙醇浓度达到最大值时，双基因缺失二倍体AS-7-2/AS-21-2与野生二倍体AS-7/AS-21相比，两者糖醇转化率分别为94.5%和93.9%，乙醇浓度为9.443g/L和9.574g/L。同时，在32h至120h发酵过程中，突变株乙醇浓度下降幅度为0.497g/L，小于野生菌株（1.134g/L）。单基因缺失二倍体突变株AS-7/AS-21-2和AS-7-2/AS-21糖醇转化率分别为92.76%和90.4%均低于出发菌株AS-7/AS-21和双基因完全缺失突变株AS-7-2/AS-21-2糖醇转化率。在32h至120h发酵过程中，AS-7/AS-21-2和AS-7-2/AS-21的乙醇浓度分别由9.47g/L和9.069g/L减少到9.107g/L和9.061g/L，均要小于AS-7/AS-21（从9.574g/L下降至8.44g/L）乙醇浓度变化，两者性能明显优于AS-7/AS-21菌株。综上所述，ADHII基因缺失对W303-1A和AS-7菌株乙醇变化无明显影响，但AS-21菌株乙醇产量有提高；双基因缺失二倍体乙醇产量高于单基因缺失和野生二倍体，而单基因缺失乙醇分解率小于野生二倍体。因此，ADHII基因缺失有利于降低菌株乙醇分解率，有利于乙醇产量维持恒定水平。