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目的:利用RNA干扰(RNAi)技术设计、构建针对人ER81基因的特异的RNAi表达体系,研究该表达体系是否抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞系中ER81的表达,促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,为乳腺癌的治疗提供新的途径。方法:1.针对ER81 mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA基因片段,构建特异的siRNA表达载体pGenesill-ETV1A/ETV1B/ETV1C-siRNA,以乱序siRNA和GAPDH-siRNA表达载体作为对照,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。2.MDA-MB-231细胞分为转染重组质粒ETV1A组,转染重组质粒ETV1B组,转染重组质粒ETV1C组,空白细胞组,转染乱序组(HK),转染空载体组(KB),转染GAPDG-siRNA组,脂质体法将基因稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,半定量RT-PCR,Western blot法检测ER81的mRNA转录和蛋白表达水平,并观察ER81mRNA的转录与蛋白表达是否受到抑制,应用流式细胞技术观察siRNA阻断ER81基因表达对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。结果:1.成功构建针对人ER81 mRNA序列siRNA表达载体以及乱序siRNA和GAPDH-siRNA表达载体,经酶切及测序鉴定完全正确。2.用脂质体法将重组质粒稳定转染MDA-MB-231细胞系,RT-PCR和Western blot检测ETV1A组、ETV1B组、ETV1C组乳腺癌细胞ER81 mRNA及ER81蛋白表达较空白细胞组,乱序组,空载体组,GAPDH-siRNA组下降,表明转染到细胞中的ER81 siRNA对ER81基因的沉默有效,其中ETV1A组、ETV1C组基因沉默效率优于ETV1B组。3.流式细胞技术检测ETV1A组、ETV1B组、ETV1C组肿瘤细胞的凋亡率与对照组相比,差异无统计学意义。结论:1.应用表达载体法成功构建ER81基因特异的siRNA干扰表达体系pGenesill-ETV1A/ETV1B/ETV1C-siRNA。2.pGenesill-ETV1A/ETV1B/ETV1C-siRNA经脂质体法转染靶细胞后能显著地发挥基因沉默效应,抑制了ER81mRNA的转录与蛋白的表达,其中以ETV1A组、ETV1C组基因沉默效应更为显著。3.流式细胞技术检测ETV1A组、ETV1B组、ETV1C组肿瘤细胞的凋亡率与对照组相比,无统计学差异。