背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见、最具侵袭性的恶性肿瘤之一,然而引起肝细胞肝癌的肿瘤发生的分子机制尚未完全明确。尽管目前肝癌诊断的工具和手段取得了长足的发展,但仅仅只有三分之一的新诊断的肝癌病人具有治疗的价值并能够得到有效的治疗。为了降低肝细胞癌的复发和转移率,目前亟需国内外的医生和科研工作者深入的研究肝细胞癌发生和发展的分子机制、通过不断的探寻影响肿瘤生长和转移的新分子进一步的探索新的能够应用于肝细胞癌病人临床诊断的生物标志物和治疗靶标。非编码RNA(non-coding RNA)包括微小RNA(micro RNA,mi RNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA),已经被证明能够参与包括HCC在内的多种肿瘤的发生发展。mi RNA是一类高度保守的长度约为20-25个核苷酸序列的小RNA,可以通过和靶基因m RNA的3’非翻译区结合抑制靶m RNA的稳定性或者抑制靶基因的翻译在转录后水平调节一系列癌基因和抑癌基因的表达。lnc RNA的长度要大于200核苷酸序列并且被报道能够通过调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等影响肿瘤的发生和发展lnc RNA可以通过直接结合DNA,RNA或者蛋白质在中心法则的各个层次上影响基因的表达,其中lnc RNA和mi RNA的相互作用也是目前国内外研究的热点问题。本论文主要是研究mi RNA和lnc RNA在HCC肿瘤形成的作用及相关机制。方法:本文所用到的组织和血液标本均来自于青岛大学附属医院肝胆胰外科和感染性疾病科,本文所用到的肝细胞癌细胞模型来自中国科学院上海细胞与生化研究所。对人HCC细胞株和正常人肝细胞进行细胞培养。细胞或者组织总RNA抽提并进行相应逆转录后,通过高通量小RNA测序技术和荧光实时定量PCR(q RT-PCR)技术分析mi RNA92b在HCC组织及血浆中的表达水平。使用q RT-PCR技术分析长链非编码RNA DANCR在HCC组织及血浆中的表达水平。同时结合临床资料分析其与临床病理的相关性。我们检测了HCC患者血浆中mi R-92b与AFP表达水平的相关性。在功能研究方面,我们使用CCK-8实验来分析mi R-92b和DANCR对HCC增殖的影响;使用细胞划痕实验来分析对HCC迁移的影响;使用Transwell侵袭实验来分析对HCC侵袭的影响。另外,我们购买了含有mi R-92b过表达慢病毒、mi R-92b knockdown慢病毒和DANCR knockdown慢病毒以及对照慢病毒,并对肝细胞癌细胞进行稳定转染,并从上海中科院购买了裸鼠构建了肝细胞癌嵌合小鼠模型,来分析对体内HCC增殖和转移的影响,通过计算体内形成的肿瘤瘤径反应HCC在体内的增殖情况,通过对肺进行切片并进行HE染色来分析HCC在体内转移的情况。在作用机制研究方面,使用q RT-PCR和蛋白免疫印迹实验来检测β-catenin下游靶点vimentin,CCND1以及MYC基因的蛋白表达情况;使用免疫荧光实验检测HCC细胞中β-catenin蛋白的定位;使用荧光素酶报告基因实验来验证β-catenin转录激活作用。最后,我们使用SPSS软件对所有的数据进行了统计学分析,统计学差异使用学生t检验、卡方检验以及单因素方差分析来进行。使用Pearson进行相关性分析;使用德隆算法比较计算两种曲线下面积的差异。结果:首先,我们发现mi R-92b在HCC患者肿瘤组织和血浆中的含量明显增加(p<0.05)。mi R-92b的表达水平和HCC患者的性别及微血管侵犯密切相关。在女性HCC患者(p=0.041)以及在脉管转移的HCC患者(p=0.026)中,mi R-92b呈现出较高的表达水平。HCC患者血浆中mi R-92b含量和AFP含量呈正相关性(p<0.001)。在针对mi R-92b在HCC中的功能研究方面,我们在细胞水平下证明mi R-92b的过表达能促进HCC细胞的增殖(p<0.001)、侵袭和迁移(p<0.05);同时mi R-92b表达水平的敲低能够明显的抑制HCC细胞的增殖(p<0.01)、侵袭和迁移(p<0.05)。mi R-92b稳定过表达后小鼠的肿瘤瘤径明显增大(p<0.05)且肺转移率明显提高,而抑制mi R-92b表达后与对照相比小鼠肿瘤瘤径(p<0.01)和肺转移率均有明显的下降。在机制研究方面,实验结果表明mi R-92b能够通过促进β-catenin蛋白的入核激活β-catenin信号通路以及下游一系列的信号分子。表明mi R-92b可以作为HCC患者临床诊断和治疗的潜在生物标记物,具有重要的临床转化意义。接着,我们针对HCC患者血浆中DANCR的表达水平和临床意义进行了分析。研究表明DANCR能够参与多种肿瘤的发生和发展,但到目前为止,DANCR在HCC诊断和发生发展中的作用仍然是未知的。我们证明DANCR在肝癌患者肿瘤组织和血浆中表达较其他三组对照组明显上调(p<0.001);血浆DANCR和肿瘤组织DANCR之间的含量呈现明显的正相关性(p<0.001);进行肝切除的HCC患者术后血浆DANCR含量明显低于术前(p<0.01),提示血浆DANCR可能来自HCC患者的肿瘤组织。并且相关性分析表明DANCR在HCC组织中的表达水平和HCC患者的分化程度(p=0.018)、微血管侵犯(p=0.003)和肝包膜侵犯(p=0.023)程度密切相关。在血浆中则和微血管侵犯(p=0.017)和肝包膜侵犯(p=0.004)程度密切相关。因此,在微血管和肝包膜侵犯的HCC患者组织和血浆中DANCR的表达水平明显升高。血浆中DANCR水平能够从健康志愿者以及非HCC患者中分辨出HCC患者,其分辨能力要优于目前临床上常用于HCC临床诊断的AFP(p=0.026)。同时,血浆中DANCR的表达水平能够对HCC患者和乙肝肝硬化患者的分辨力较高,其分辨力要显著的优于AFP(p=0.001)。因此,血浆中DANCR水平的检测是一种潜在的用于HCC患者诊断的生物学标记物。另外,进一步的基础实验研究表明,DANCR的下调能够明显抑制β-catenin蛋白的表达水平进而抑制β-catenin信号通路以及下游效应分子。DANCR的敲低能够明显抑制HCC细胞的增殖(p<0.01)和转移(p<0.05),HCC嵌合小鼠模型实验表明DANCR的敲低能够明显的抑制HCC细胞在裸鼠中成瘤的瘤径(p<0.01)和肺转移率。综上所述,我们的研究表明DANCR能够作为HCC患者的诊断以及HCC疾病发生发展的潜在生物标志物。讨论和结论:mi R-92b和DANCR在HCC患者肿瘤组织和血浆中明显上调;mi R-92b能够在体内和体外水平促进HCC细胞的增殖和转移;mi R-92b能够激活β-catenin信号通路;与AFP相比,血浆中DANCR对于HCC患者具有更高的诊断效能;DANCR的knockdown能明显抑制HCC细胞的增殖和转移。总体来说,mi RNA和lnc RNA在HCC中发挥的重要作用已经得到了越来越多中外科学家的关注和研究。尽管很多HCC相关的mi RNA和lnc RNA的功能研究已经取得了长足的进步和发展,但是目前人们仅仅只是研究清楚了一小部分非编码RNA的功能和特点,绝大部分的mi RNA和lnc RNA仍然需要进一步的被发现和研究。因此,对于HCC特异表达的mi RNA和lnc RNA的功能和相关机制仍然是急需研究解决的。我们相信越来越多的mi RNA和lnc RNA相关的研究能够为寻找新的HCC肿瘤标志物和治疗靶点开辟一条崭新的道路。