胎膜早破（Premature Rupture of Membrane，PROM)是指临产前发生的胎膜破裂，可以给孕产妇和新生儿的健康造成严重影响，可引发感染、胎盘早剥、产后出血、早产、脐带受压等多种危及母儿健康和生命的疾病。妊娠期发生胎膜早破的因素很多，但其最基本的病理变化是炎症和胎膜本身结构的缺陷。近年来国内外学者主要从胎膜结构的变化、机械外力、感染因素、免疫等方面研究胎膜早破发生的原因，并且取得了极大的进展。感染一直是学者们公认的与胎膜早破发生最为密切的相关因素之一。临床上有部分孕妇在出现破膜前后处于亚临床感染状态，无明显的表现。因此早期诊断合并有感染的胎膜早破尤为重要。其中细菌感染、支原体和衣原体感染是导致生殖道炎症的常见因素。Toll样受体(Toll like receports，TLRs)是参与体内的固有免疫的一类古老的蛋白质家族。TLRs在细胞信号转导中发挥重要的作用，是激活相关细胞分泌炎性介质的闸门受体，其中TLR-2是TLRs家族中表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多的分子之一。病理研究结果亦证实早破胎膜的特征为胎膜中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白质表达的低水平。基质金属蛋白(matrix metalloproteinases，MMPs)几乎能降解ECM的所有成分，其中MMP-2在整个妊娠期持续表达。但PROM的具体发病机制尚未完全阐明，目前尚无理想的防治办法。本文旨在通过研究TLR-2和MMP-2在胎膜早破患者和正常妊娠晚期胎盘和胎膜组织中的表达情况及两者之间的关系来进一步揭示其发病机制，可能为预防与治疗PROM提供研究方向。目的本文旨在通过研究TLR-2mRNA，MMP-2mRNA及其蛋白在足月胎膜早破组和正常晚孕组胎膜组织中的表达是否存在差异，免疫组化法定位TLR-2和MMP-2在两组孕妇的胎盘和胎膜组织中的位置，探讨两者在胎膜早破发生、发展过程中的作用及其关系。材料和方法1.研究对象随机选取2012年9月─2013年1月因胎膜早破在郑州大学第三附属医院住院并且以剖宫产术结束妊娠的足月胎膜早破孕妇30例作为实验组(PROM组)，胎膜早破的诊断依据乐杰主编的第七版《妇产科学》教材。随机抽取同期以剖宫产术结束妊娠的正常晚期、胎膜完整的妊娠妇女30例，作为对照组。两组病例所有孕妇均无其他母体疾病或者产科并发症。两组孕妇均为初产、单活胎，剖宫产指征为孕妇的骨盆狭窄或者孕妇要求等。2.方法两组孕妇均知情同意。所有标本的采集均在胎盘娩出后20min内进行，选择脐带附着处的母体面胎盘组织，垂直剪切2块组织(大小约2cm×2cm×2cm)，避开梗死、钙化灶、出血等异常位置；剪切胎膜早破患者破口周围胎膜2块(大小约2cm×2cm)。将获得的组织以0.9%氯化钠溶液漂洗干净，无菌滤纸去除组织上的血液，1块组织保存于10%甲醛溶液中用于石蜡包埋切片，另外1块置于无菌冻存管—80℃保存，用于提取mRNA。光学显微镜下行病理学检查用于诊断绒毛膜羊膜炎。采用Real-time PCR法检测实验组和对照组孕妇胎膜组织中TLR-2mRNA和MMP-2mRNA的表达。采用免疫组化法(SP法)检测30例足月胎膜早破和30例正常组胎盘胎膜组织中TLR-2和MMP-2蛋白的定位与表达。3.统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行统计学上的分析。计量数据的统计结果以均数±标准差(x s)表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析进行，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD-t法)。两变量的相关性采用Pearson相关分析。选择α=0.05为检验水准。结果1.PROM组和对照组孕妇一般临床数据情况的比较PROM组和对照组孕妇相比，PROM组年龄在23-35岁之间，平均年龄25.341±5.484岁；孕周在37-41周之间，平均孕周38.516±2.124周。同期正常的妊娠妇女作为对照组，年龄在23-35岁之间，平均年龄25.841±3.334岁，孕周在37-41周之间，平均孕周38.433±1.764周。孕时BMI分别为29.023±3.841，29.534±3.681，两组孕妇的年龄、孕时BMI、孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.PROM组与正常对照组晚孕期胎膜组织中TLR-2mRNA，MMP-2mRNA的表达两组孕产妇胎膜组织中均可检测到TLR-2mRNA，MMP-2mRNA的表达，PROM组TLR-2mRNA， MMP-2mRNA相对表达量分别为0.581±0.142，0.616±0.164，正常对照组分别为0.353±0.191，0.348±0.123；胎膜组织中实验组TLR-2mRNA、MMP-2mRNA的表达水平均较对照组明显升高，且差异有统计学意义(P<0.001)。3.PROM组与正常对照组晚孕期胎盘胎膜组织中的TLR-2与MMP-2蛋白的定位表达附图2为胎盘胎膜组织阴性对照和HE染色结果，阴性对照：免疫组化过程中用PBS代替一抗得到的结果；免疫组化结果显示：TLR-2和MMP-2蛋白在PROM组及正常对照组胎盘胎膜组织中均有表达，在PROM组胎盘胎膜组织中的染色强度明显高于正常对照组，两组相比差异有统计学意义(P<0.001)。在PROM组胎盘组织中TLR-2主要表达于合体滋养细胞的细胞膜、细胞质内，MMP-2主要表达于合体滋养细胞的细胞质内，呈棕黄色颗粒沉着；另外在胎盘绒毛和蜕膜间质中也偶有TLR-2表达，MMP-2在胎盘绒毛血管内皮细胞以及间质细胞里少量表达，TLR-2和MMP-2在PROM组胎膜组织表达于羊膜上皮细胞和绒毛膜的细胞滋养细胞，TLR-2、MMP-2的表达定位在实验组、对照组基本相同，但实验组大多细胞的细胞质内可明显见到棕染的颗粒。应用病理图像分析系统测定TLR-2与MMP-2的平均光密度值，测定结果如下：PROM组胎盘组织中TLR-2与MMP-2的平均光密度值分别为0.141±0.011和0.186±0.015，正常足月组TLR-2与MMP-2的平均光密度值分别为0.083±0.004和0.118±0.007，PROM组和正常足月组相比差异有显著性(均P<0.001)。胎膜组织中PROM组TLR-2与MMP-2的平均光密度值比较分别为0.318±0.007，0.486±0.015，正常足月组TLR-2与MMP-2的平均光密度值分别为0.283±0.0040.341±0.011，PROM组和正常足月组差异有显著性(均P<0.001)。胎膜组织中的TLR-2与MMP-2蛋白表达量的相关性：在正常妊娠组二者不存在相关，足月胎膜早破组中存在显著正相关。(r=0.166，P>0.05；r=0.434，P<0.05)4.绒毛膜羊膜炎患者胎膜组织中的TLR-2与MMP-2蛋白的水平变化胎膜病理检查结果显示：两组孕妇发生绒毛膜羊膜炎的共15例，其中胎膜早破组绒毛膜羊膜炎13例，感染率为21%；对照组绒毛膜羊膜炎2例，感染率为3.3%。绒毛膜羊膜炎患者胎膜中TLR-2和MMP-2的水平明显高于非绒毛膜羊膜炎患者，两者比较差异有统计学意义(P <0.001及P <0.001)。5.PROM组不同Apgar评分新生儿的胎膜组织中TLR-2与MMP-2蛋白的水平胎膜早破组Apgar评分≤7分新生儿的胎膜组织中TLR-2和MMP-2的水平显著高于Apgar评分≥8分的新生儿，两者比较差异有统计学意义(P<0.001及P<0.001)。6.PROM组不同破膜时间的患者胎膜组织中的TLR-2与MMP-2蛋白的水平变化随破膜时间的延长PROM组患者胎膜组织中的TLR-2与MMP-2蛋白的水平升高，尤其是破膜时间超过24小时升高更为明显。不同破膜时间的患者TLR-2与MMP-2蛋白的水平比较，差异有统计学意义(均P<0.001)。结论孕妇胎盘胎膜组织中TLR-2与MMP-2表达的增多可能促进了足月胎膜早破的发生。足月胎膜早破组TLR-2与MMP-2的表达存在显著正相关，说明两者可能通过某种机制共同参与调节胎膜破裂的过程。