研究背景目前,缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease,IHD)仍然是全球死亡率和致残率的主要原因。及时的再灌注治疗是临床上最有效的方法,但恢复血供后也有可能导致心肌细胞损伤进一步加重,即心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury,MIRI)。然而,临床上几乎没有有效的药物可以保护心肌免受缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤。苦参碱(Matrine)是从中草药苦参(Radix Sophorae Flavescentis)中提取的一种喹诺西啶生物碱类化合物,具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗纤维化、抗心律失常、改善心功能不全等多种药理作用。有研究表明苦参碱减轻了肝I/R损伤以及局灶性脑缺血损伤。最近研究发现,苦参碱对异丙肾上腺素诱导的急性心肌损伤具有心血管保护作用。还有研究显示苦参碱预处理改善了糖尿病心肌病大鼠的心功能不全。然而,苦参碱在心肌I/R损伤中的作用机制尚不清楚。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活因子(Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription,JAK/STAT)通路在介导对I/R损伤的心脏保护中发挥重要作用。许多研究发现,JAK2/STAT3信号通路特异性地参与心肌I/R损伤的预防。最近的研究表明苦参碱通过抑制JAK2/STAT3信号来抑制人类慢性粒细胞白血病细胞和胆管癌细胞的生长;也有研究证实苦参碱通过抑制JAK/STAT信号通路的激活、诱导胶原性关节炎大鼠的成纤维细胞的凋亡。然而,在I/R损伤的心肌细胞中,苦参碱对JAK/STAT信号传导的激活作用仍然是未知的。热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是应激反应蛋白的家族,在所有暴露应激条件下的物种中都能发现。热休克蛋白抑制一些蛋白质的磷酸化,并提高这些蛋白质的稳定性和功能。HSP70作为热休克蛋白的代表性成员,发现其是一种心脏保护性物质,它能抑制心肌I/R损伤后的心肌细胞凋亡。最近的研究表明HSP70通过抑制心肌I/R损伤中的自噬,抑制心肌细胞坏死。还有研究通过抑制磷酸化真核延伸因子2的酰化和细胞核转位,证实HSP70在心肌I/R损伤期间保护心肌细胞。HSP70可被JAK/STAT途径激活,然而,在心肌细胞I/R损伤中,HSP70与JAK2/STAT3信号通路之间的关系仍然未知。同时,苦参碱在心肌I/R损伤中的功能是否与HSP70表达有关,目前尚未见报道。基于上述资料,我们推测苦参碱可能减轻心肌I/R损伤。本研究的第一部分通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型,探讨苦参碱对心肌I/R的保护作用,通过检测JAK2/STAT3信号通路及HSP70的变化进一步揭示苦参碱对心肌I/R的保护作用机制。第二部分通过培养原代心肌细胞观察苦参碱对JAK2-STAT3-HSP70的调控。研究目的首先观察苦参碱是否对心肌I/R损伤有保护作用,其次观察苦参碱是否通过调控JAK2/STAT3通路上调HSP70的表达发挥心肌I/R损伤的保护作用,了解苦参碱在心肌I/R损伤中的分子机制。本研究分为以下两个部分:第一部分苦参碱对SD大鼠心肌I/R损伤的作用及对JAK2-STAT3表达的调控方法(1)模型构建:雄性SD大鼠24只,将动物随机分为4组,每组6只,(1)假手术组,(2)I/R组;(3)I/R+Matrine(50 mg/kg)组;(4)I/R+Matrine(100 mg/kg)组。制造大鼠发生心肌I/R损伤模型,对大鼠进行30分钟的缺血,然后再灌注24小时。假手术组大鼠进行同样的手术,没有LAD闭塞。(2)处理:I/R+Matrine,在大鼠I/R前每天腹腔注射50 mg/kg或100 mg/kg(1 mL)苦参碱,共7天,其余各组大鼠均给予相同体积的盐水。(3)结果鉴定:通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定肌酸激酶-同工酶(Creatine Kinase-Myocardial Band,CK-MB)和心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I,cTnI)的水平来检测心肌损伤的程度。通过氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测梗死面积。Western blot检测HSP70、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果(1)在大鼠动物模型中,与假手术组相比,I/R组心肌细胞CK-MB和cTnI水平明显升高(P<0.01),而在苦参碱治疗组CK-MB和cTnI呈剂量依赖性地显著降低(和I/R组相比,P<0.01)。(2)通过TTC染色分析大鼠心肌的梗塞面积,苦参碱治疗呈剂量依赖性地减轻I/R损伤诱导的梗塞面积的百分比(和I/R组相比,P<0.01)。(3)蛋白质印迹分析检测Bax,Bcl-2和caspase 3蛋白的表达,结果显示I/R损伤显著升高活化的caspase-3水平和Bax/Bcl-2的比例(与假手术组相比,P<0.01),而通过苦参碱处理以剂量依赖性方式降低凋亡相关蛋白Bax表达(与I/R组相比,P<0.01),定量Bax/Bcl-2的比率,活化的caspase 3水平(和I/R组相比,P<0.01)。(4)在I/R动物大鼠模型中用50mg/kg或100mg/kg苦参碱处理后,检测HSP70,p-JAK2,JAK2,p-STAT3和STAT3的蛋白质水平,结果表明,与假手术组相比,I/R明显升高HSP70蛋白的表达(P<0.01),I/R明显降低p-JAK2,p-STAT3水平及p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值(P<0.01)。苦参碱以剂量依赖的方式显著增加HSP70的表达(与I/R组相比,P<0.05或P<0.01);而苦参碱治疗后明显升高HSP70蛋白水平的表达和p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值(与I/R组相比,P<0.05或P<0.01)。第二部分苦参碱对原代培养心肌细胞JAK2-STAT3-HSP70的调控方法(1)24小时内新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的心肌细胞分离和培养,选用不同浓度的苦参碱(0,50,100,200,400,600,800μM)处理原代大鼠细胞,将心肌细胞进行缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)处理。选用不同浓度的苦参碱(200,400μM)处理H/R细胞,缺氧4小时,然后在含常氧的培养箱中孵育6小时进行复氧。实验分为4组,(1)对照组;(2)H/R组;(3)H/R+200μM Matrine;(4)H/R+400μM Matrine。通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)分析确定心肌细胞的活力。酶联免疫检测仪评估乳酸脱氢酶(LDH)释放和肌酸激酶(CK)活性。Western blot检测Bcl-2、Bax和Active Caspase 3蛋白水平及Bax/Bcl-2比值的表达。(2)观察JAK2/STAT3通路阻断剂AG490对苦参碱抗心肌细胞H/R作用的影响。实验分为3组,(1)H/R组;(2)H/R+400μM Matrine;(3)H/R+400μM Matrine+2μM AG490组。使用酶联免疫检测仪评估乳酸脱氢酶(LDH)释放和肌酸激酶(CK)活性。PCR检测HSP70mRNA的水平;Western blot检测HSP70、Bcl-2、Bax和Active Caspase 3蛋白水平及Bax/Bcl-2比值的表达。(3)观察HSP70siRNA阻断HSP70对苦参碱抗心肌细胞H/R作用的影响。实验分为3组,(1)H/R组;(2)H/R+400μM Matrine;(3)H/R+400μM Matrine+HSP70siRNA组。HSP70 siRNA转染心肌细胞24小时,然后进行H/R刺激。将细胞在加有或不加400μM苦参碱的培养基中培养,缺氧4小时后,并在常氧培养箱中孵育6小时再复氧。使用酶联免疫检测仪评估乳酸脱氢酶(LDH)释放量和肌酸激酶(CK)活性。实时荧光定量PCR检测HSP70mRNA的水平;Western blot检测HSP70蛋白的表达。结果(1)苦参碱保护心肌细胞免受体外H/R诱导的损伤。用不同浓度的苦参碱处理原代大鼠心肌细胞,用CCK8分析来测定细胞活力,含量为50-400μM苦参碱处理对原代大鼠心肌细胞活力无影响。用200μM或400μM苦参碱处理心肌细胞,缺氧4小时,然后在常氧培养箱中孵育6小时再复氧,用CCK8测定细胞活力发现用200μM或400μM苦参碱处理心肌细胞存活力明显升高(与缺氧/复氧组相比,P<0.05或P<0.01)。测定LDH释放水平和CK活性,与对照组相比,H/R明显升高LDH释放水平和CK含量(P<0.01);而苦参碱处理组明显降低LDH释放水平和CK含量(与缺氧/复氧组相比,P<0.05或P<0.01)。(2)蛋白质印迹分析发现H/R组明显升高活性半胱氨酸蛋白酶3和Bax,Bax/Bcl-2比率比值,降低Bcl-2的蛋白质水平(对照组相比,P<0.01);而苦参碱组明显降低活性半胱氨酸蛋白酶3和Bax水平的定量,Bax/Bcl-2比率比值,(与缺氧/复氧组相比,P<0.01)。(3)苦参碱通过激活JAK2/STAT3信号抑制H/R诱导的心肌细胞损伤。蛋白质印迹分析检测培养的心肌细胞中p-JAK2、JAK2,p-STAT3和STAT3的表达水平,升高p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的比值(对照组或H/R组相比,P<0.05或P<0.01)。(4)在H/R处理之前30分钟用JAK2抑制剂AG490(2μM)对心肌细胞进行预处理,并孵育整个H/R过程,然后测定LDH的含量和分析CK的活性;苦参碱降低LDH和CK活性(H/R组相比,P<0.01);AG490能逆转苦参碱对H/R心肌细胞的作用(与苦参碱组相比,P<0.05或P<0.01)。(5)蛋白质印迹分析Bax,Bcl-2和活性半胱氨酸蛋白酶3的水平;不同处理组中Bax/Bcl-2(G)比值的定量,不同处理组中活性半胱氨酸蛋白酶3水平。AG490可以逆转苦参碱对H/R心肌细胞的保护作用(与苦参碱组相比,P<0.05或P<0.01)。(6)HSP70介导苦参碱对H/R诱导的心肌细胞损伤的作用。测定心肌细胞中的HSP70 mRNA表达和HSP70蛋白水平(对照组或H/R组相比,P<0.05,或P<0.01)。用对照siRNA或HSP70 siRNA转染心肌细胞,并测定HSP70蛋白质水平(与对照组相比,P<0.01)。用HSP70 siRNA转染心肌细胞,然后进行H/R刺激,将细胞在含400μM苦参碱的培养基中培养,检测心肌细胞LDH的水平和CK的活性(与H/R组,P<0.01)。HSP70 siRNA可以逆转苦参碱的上述作用(苦参碱组相比,P<0.01)(7)苦参碱通过激活JAK2/STAT3通路引起HSP70表达升高。在H/R处理之前30分钟用JAK2抑制剂AG490 2μM预处理心肌细胞,并孵育整个H/R过程。测定HSP70 mRNA水平和HSP70蛋白质表达(与H/R组相比,P<0.01)。AG490可以逆转苦参碱对H/R心肌细胞HSP70 mRNA和HSP70蛋白质水平的表达(与苦参碱组相比,P<0.01)结论(1)苦参碱有心肌I/R损伤的保护作用;苦参碱在心肌I/R损伤中的分子机制主要集中在JAK2/STAT3通路激活和HSP70表达上。(2)苦参碱的心肌I/R损伤的保护作用被JAK2抑制剂AG490和HSP70siRNA阻断,AG490可降低苦参碱增加的HSP70表达。(3)苦参碱通过激活JAK2/STAT3通路上调HSP70的表达来减轻心肌细胞I/R损伤。