【摘 要】
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本实验室前期以火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey,HVT）疫苗株（FC-126）为载体,构建了表达H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）主要保护性抗原HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-H9-HA。该疫苗既可以弥补常规禽流感灭活疫苗的缺点,又可同时提供对马立克氏病和H9亚型禽流感的免疫保护,具有非常广阔的应用前景。根据我国农业转基因
【基金项目】
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2020年江苏省现代农业发展项目（2020-SJ-003-YD16）； 财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系（CARS-40-K16）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；
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本实验室前期以火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey,HVT）疫苗株（FC-126）为载体,构建了表达H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）主要保护性抗原HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-H9-HA。该疫苗既可以弥补常规禽流感灭活疫苗的缺点,又可同时提供对马立克氏病和H9亚型禽流感的免疫保护,具有非常广阔的应用前景。根据我国农业转基因生物安全评价管理办法的要求,转基因微生物在临床应用前必须对其进行以风险评估、风险管理和风险交流为基础的科学风险分析,因此,本研究对该重组活载体疫苗进行生物安全评价。1.重组病毒rHVT-H9-HA的稳定性、竞争性及生存适应能力评价将重组病毒rHVT-H9-HA在鸡胚成纤维细胞（CEF）上连续传20代,通过间接免疫荧光试验（IFA）检测H9亚型AIV HA蛋白的表达情况;将等量rHVT-H9-HA与母本病毒HVT FC-126株同时混合感染单层CEF,并连续传10代,通过荧光定量PCR方法分别检测总病毒基因组拷贝数和rHVT-H9-HA基因组拷贝数的比例,来评价 rHVT-H9-HA 与 HVTFC-126 株的竞争性;通过 rHVT-H9-HA 与 HVTFC-126 株分别在不同温度、pH、乙醚、氯仿、胰酶等作用条件下病毒噬斑数的变化,来评价rHVT-H9-HA的生存适应能力。结果表明,重组病毒rHVT-H9-HA连续传20代后,仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白;重组病毒rHVT-H9-HA与HVT FC-126株共感染传代,其复制能力与HVT FC-126相比无明显差异;重组病毒rHVT-H9-HA与HVT FC-126株在55℃和65℃作用15 min均可被灭活,在37℃和45℃条件下随着作用时间的延长病毒噬斑数有所下降,对乙醚和氯仿敏感,对胰酶具有一定的耐受性,在pH3、pH5和pH10条件下不具有耐受性,对超声波、紫外线及常用消毒剂敏感。研究结果表明,重组病毒rHVT-H9-HA具有良好的稳定性,且具有与母本病毒HVT FC-126株相似的复制能力和生存适应能力。2.重组病毒rHVT-H9-HA对靶动物的生物安全评价以5000PFU/羽份的重组病毒rHVT-H9-HA经颈部皮下接种1日龄SPF鸡,同时设置PBS组作为阴性对照组,对鸡群进行连续20周的临床观察和生长状况监测。每周称量各组试验鸡的体重,分析该重组病毒对鸡群增重的影响;每周每组扑杀3只试验鸡,分别采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏和法氏囊进行常规观察、称重以及病理组织学检查;每周采集血清,检测试验鸡血清的HI抗体效价;每周采血分离淋巴细胞,并将其接种于单层CEF进行病毒的分离和定量,评价该重组病毒在鸡体内的复制和持续时间;通过荧光定量PCR方法检测重组病毒rHVT-H9-HA在各组织中的分布情况。结果显示,试验期间各实验组鸡精神、采食、饮水均正常;试验鸡增重和内脏器官称重显示接种重组病毒rHVT-H9-HA对鸡无不良影响;采集的各组织在剖检和组织学检查中均未出现病理变化;试验鸡H9亚型AIV的HI效价持续上升,在8周龄时达到顶峰,此后呈下降趋势;重组病毒rHVT-H9-HA在鸡体内的含量不断提高,在7周龄时达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能分离到少量重组病毒,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间;从第二周开始,试验鸡各组织中检测到重组病毒rHVT-H9-HA。试验结果表明,重组病毒rHVT-H9-HA对靶动物（鸡）具有良好的安全性。3.重组病毒rHVT-H9-HA对非靶动物的生物安全评价将重组病毒rHVT-H9-HA按照5000PFU/羽份的免疫剂量经颈部皮下接种1日龄肉鸭,同时设置PBS组作为阴性对照组,连续观察35天,通过对试验鸭的常规观察、病毒分离、外源基因检测、内脏器官称重和病理组织检查等,评估重组病毒rHVT-H9-HA对非靶动物（鸭）的安全性。结果显示,实验期间各组试验鸭精神、采食、饮水均正常,;血液中未分离到重组病毒;各组织中未检测到外源基因;内脏器官观察、称重和组织切片检查显示接种重组病毒rHVT-H9-HA对鸭无不良影响。试验结果表明,重组病毒rHVT-H9-HA对非靶动物（鸭）具有良好的安全性。
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