细胞周期是一个高度保守,且受到严格调控的生物学过程,对于生物体组织发育、体内平衡的维持和遗传信息的传递至关重要。家蚕（Bombyx mori）作为鳞翅目昆虫的重要模式,对其发育过程中细胞周期调控机制的研究具有重要意义。细胞周期的调控涉及多种细胞因子的参与,其中E2F（腺病毒早期区域E2结合因子,E2 factor）转录因子家族是重要的一员,在细胞周期进程中扮演着重要的角色,研究家蚕E2F基因在细胞周期调控过程中的功能,可为阐释家蚕个体发育及其丝腺特有的核内有丝分裂机制提供理论基础。本研究对家蚕E2F基因的序列特征和表达模式进行了分析,并探究了其家族成员BmE2F4基因对家蚕细胞周期和丝腺细胞核内有丝分裂的作用,进而通过免疫共沉淀和质谱分析筛选并鉴定了其相互作用蛋白。获得的主要研究结果和结论如下:1.BmE2F基因的序列分析和表达模式分析结合家蚕SilkDB、SilkBase和NCBI等数据库,通过生物学信息分析发现家蚕中存在3个E2F基因,其中BmE2F1基因的CDS序列全长1443 bp,由11个外显子和10个内含子组成,编码的蛋白含481个氨基酸残基;BmE2F4基因的CDS序列全长783 bp,由7个外显子和6个内含子组成,编码的蛋白含261个氨基酸残基;BmE2F7基因的CDS序列全长1008 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码的蛋白含336个氨基酸残基。利用在线工具SMART对家蚕BmE2F蛋白进行结构域预测,结果表明,家蚕E2F蛋白含有E2F家族保守的E2F-TDP结构域,并且BmE2F4蛋白还具有二聚化结构域。以家蚕E2F的全长氨基酸序列为种子序列进行同源检索,获得多个物种的E2F氨基酸序列,利用软件Clustalx1.83和MEGA6.0构建系统进化树,结果显示,包括家蚕在内的所有鳞翅目昆虫的E2F蛋白首先聚为一支,然后再与脊椎动物聚为一支,表明家蚕E2F蛋白在不同物种间具有保守性。通过半定量检测BmE2F基因在家蚕五龄三天不同组织中的表达情况,结果表明,BmE2F基因在丝腺组织中均有表达,其中BmE2F4基因在丝腺中表达量较高且较为特异。进一步对不同发育阶段丝腺中BmE2F基因的时期表达情况进行分析,结果显示,BmE2F4基因在盛食期家蚕幼虫的丝腺中低量表达,在眠期表达量升高,并且在四龄眠期表达量达到最高,之后表达量逐渐降低,而BmE2F1和BmE2F7基因无明显变化趋势。2.BmE2F4基因对家蚕细胞周期的影响在BmN-SWU1细胞中过表达和干涉BmE2F4基因,并利用流式细胞术、EdU标记、CCK-8增殖活力检测和qRT-PCR技术分析细胞周期的变化情况。结果显示,在BmN-SWU1中过表达BmE2F4基因使细胞周期阻滞在G1期,DNA复制和细胞增殖活力被显著抑制;干涉BmE2F4基因使S期细胞比例增加,EdU标记率显著上升,细胞增殖活性显著升高,表明干涉BmE2F4基因能够促进细胞的DNA复制和增殖。利用qRT-PCR技术分别检测过表达和干涉BmE2F4基因后相关周期调控因子的相对表达量,结果显示,过表达BmE2F4基因后,周期蛋白BmCyclin A和BmCyclin E以及周期蛋白依赖性激酶BmCDK1和BmCDK2的相对表达量显著下调;干涉BmE2F4基因后,周期蛋白BmCyclin A、BmCyclin B和BmCyclin E以及周期蛋白依赖性激酶BmCDK1和BmCDK2的相对表达量显著上调。3.BmE2F4基因对家蚕丝腺组织DNA复制的影响通过qRT-PCR技术对BmE2F4基因在家蚕胚胎期三个关键时期24期、25期和26期丝腺的相对表达量进行分析,结果显示,BmE2F4基因在进行有丝分裂的24期丝腺组织中相对表达量较高,在转换期和进行核内有丝分裂的25期和26期丝腺组织中的相对表达量显著降低。通过体外培养四龄三天家蚕丝腺组织和5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2’-deoxyueidine,BrdU）标记,结果表明,BmE2F4基因能够抑制丝腺细胞的DNA复制。4.BmE2F4基因调控家蚕细胞周期机制的初步研究为了探究BmE2F4基因调控家蚕细胞周期的作用机制,本研究以BmE2F4蛋白为诱饵蛋白,进行免疫共沉淀和质谱分析,筛选到9个可能与BmE2F4存在相互作用的蛋白。进一步通过免疫共沉淀技术验证了Bm14-3-3ζ蛋白与BmE2F4存在相互作用,且BmE2F4基因能够抑制Bm14-3-3ζ的表达。利用流式细胞术和CCK-8细胞增殖活力检测分析过表达Bm14-3-3ζ基因对细胞周期的影响,结果显示,Bm14-3-3ζ使细胞周期阻滞在G1期,并能够抑制细胞增殖。