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脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力障碍疾病。1991年在Xq27.3处克隆了该病的疾病基因——脆性X智力障碍1基因(fragile X mental retardation 1 gene,FMR1)。FMR1基因跨越38Kb,由17个外显子和16个内含子组成,编码一功能未明的RNA结合蛋白。已证实FMR1基因存在多种可变剪接方式,主要涉及四个外显子,并且在不同组织中其剪接形式并非一致,但其具体的功能仍未明确。同时,FXS发病率高、临床表现复杂多样、并存在传递扩展的遗传特性,因此,建立完善的实验室诊断方法尤为重要。本研究依据FMR1基因突变的特点,分别从基因组DNA和mRNA两条途径建立FXS分子诊断方法。采用甲基化特异性PCR,从基因组DNA途径检测FMR1基因5′端非翻译区CGG重复情况和CpG岛甲基化状态;采用长链RT-PCR技术,以cDNA为模板,扩增FMR1基因编码区全长序列,再分4个片段进行二次PCR,并对PCR产物直接测序。利用上述方法对一疑似FXS患者及其家系成员进行了检测。同时,本研究利用克隆-测序技术,从RNA水平对该患者外周血FMR1基因的可变剪接产物进行分析。利用长链RT-PCR扩增FMR1基因编码序列,并将其插入T克隆载体进行序列测定,进一步分析剪接异构体表达情况。结果显示:在所检测的19个克隆中存在11种剪接转录产物,其中发现6个涉及FMR1基因内含子9部分片段的插入的剪接转录产物(6/19)。针对新发现的FMR1基因内含子9部分片段的插入的剪接方式,本研究利用生物信息学技术对FMR1基因内含子9序列进行剪接信号相关分析,证明该内含子插入片段可能为一个隐秘外显子(cryptic exon)。同时,分析结果显示,该隐秘外显子的出现,提前引入终止密码子,可能通过NMD途径导致转录产物降解,使功能性FMRP减少。本研究还利用克隆-测序技术,以四个正常人外周血样本和一份脑组织cDNA文库为模板,进一步分析了FMR1基因剪接转录产物表达情况。结果显示:在所检测的四个正常人外周血中共检测到16种剪接产物,不同个体存在不同程度的FMR1基因剪接表达,并在一个正常人中发现两个未曾报道过的剪接产物;而在脑组织中共检测到9种剪接产物,并从中发现一个涉及外显子15一个新的剪接受点的剪接产物。本研究建立的一套FXS分子诊断方法体系,将为FXS的临床诊断、产前诊断和遗传咨询提供可靠的科学依据。发现的新型可变剪接转录产物,将为研究FMRP功能、FXS发病机制奠定基础。