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窖蛋白(caveolin)在调节胆固醇的运输和细胞内稳态中起重要作用,它是一种胆固醇结合分子,可以根据脂蛋白浓度的变化高效调节胆固醇从内质网转移到细胞表面,在细胞表面胆固醇变成胞外微粒,如高密度脂蛋白。而在猪体内,除瘦肉外其它组织中均含有过多的胆固醇。在猪肉组织中Caveolin—1(Cav1)是如何调节胆固醇的含量,以及如果利用Cav1来降低猪肉中的胆固醇含量,是本课题的研究目标之一。因此我们需要在细胞水平上完成对Cav1基因表达的调控研究。为了实现这一前期目标,在本研究中我们采用了两种策略来进行:其一,构建慢病毒载体,进行目的基因的超表达与抑制;其二,筛选并鉴定其核心转录因子,并通过它来调控Cav1基因的转录。主要研究结果如下:
1)将猪Cav1基因的编码区成功构建到慢病毒载体中,并进行了病毒包装和滴定度的测定,感染PK15细胞后,Cav1基因的表达得到显著提高,表明已成功构建猪Cav1基因的慢病毒超表达载体。
2)筛选到三个有效的RNAi片段,并成功将其中的一个构建到慢病毒载体中,进行了病毒包装和滴度测定。
3)利用长片段PCR克隆得到了猪Cav1基因的启动子序列,并将其连接到pGL3—basic报告基因载体中,转染C2C12细胞发现报告基因的活性显著升高,证明了该启动子的有效性。
4)利用启动子分析软件TESS对启动子中可能的调控元件进行了预测,通过引物缺失、嵌套缺失以及定点突变技术构建了各种缺失突变的报告基因载体进行转染,发现位于Cav1启动子中—411~—402bp处的序列是一个非常关键的结合位点,它的突变对该启动子活性影响很大。
5)凝胶阻滞电泳实验证实了Cav1启动子中—411~—402bp处的结合位点与Sp1转录因子的结合。
6)位于启动子区—354~—342的CCAAT box的结合位点突变后,其的所在启动子活性下降也极其显著,几乎与pGLB的水平相当,是另一个潜在的关键转录因子结合位点。