L-氨基酸氧化酶(LAAO;EC 1.4.3.2)是一种黄素类蛋白酶,能特异性催化L-氨基酸氧化脱氨,生成α-酮酸、H2O2和氨。LAAO因具有诱导细胞凋亡、抑菌、抗艾滋病病毒等多种生物学活性而备受国内外研究者的重视。本课题期望借助于转座子随机插入突变技术来研究Pseudoalteromonas sp.Rf-1 产 LAAO 的分子调控机理。首先,我们建立了一种二甲酚橙琼脂平板定量表征LAAO活性的方法,其具有灵敏度高、简单方便、环境友好、适用性广、价廉等优点。随后,我们将E.coli S17-1(λπ)(pLOF/Km)中转座子mini-Tn10引入Pseudoalteromonas sp.Rf-1菌株中,构建了含4000多个突变子的突变体库。通过大小、颜色等表型筛选,我们挑取了其中的2000多株突变子,利用普鲁士蓝琼脂平板法结合二甲酚橙琼脂平板法进行了LAAO酶活检测,从中筛选到3株LAAO酶活增强的突变株(B3、B21、B22),5株 LAAO 酶活降低的突变株(B9、B10、B11、B17、B20)及4株LAAO酶活缺失的突变株(B1、B6、B12、B19)。采用热不对称PCR和随机引物PCR成功获得这12株突变株中mini-Tn10位点突变基因的部分序列。经同源性分析,除B10中突变基因与Alcanivorax dieselolei B5的tbdR基因同源性为68%之外,其余突变株中突变基因均与已知的P.rubra ATCC 29570部分序列高度相似。B22中突变基因与gntR基因同源性为72%;B11、B17及A15中突变基因分别与 Hypothetical protein 基因(88%)、nrpS 基因(82%)、Methylase编码基因的上游非编码序列(80%)高度相似;B1、B6、B12、B19中突变基因分别与sdmt(80%)、karo(80%)、nat5(80%)、nhaD(81%)基因序列高度相似。对这些基因进行功能分析后发现,它们可能参与调控LAAO的合成、运输或修饰。利用三亲结合实验,对其中的突变株B1、B19(LAAO酶活力完全缺失)的突变基因sdmt、nhaD分别进行基因互补,结果表明,互补菌 B1/pBBR1MCS-5sdmt、B19/pBBR1MCS-5nhaD 产 LAAO 酶活能力基本恢复,证明基因sdmt和nhaD在Pseudoalteromonas sp.Rf-1中对LAAO的产生起正调控作用。