离子型谷氨酸受体NMDA受体(NMDAR)是一类重要的配体门控性离子通道，对钙离子具有高通透性是其重要特点。缺血性脑卒中等病理情况下，NMDAR过度激活会介导过量钙离子内流，造成神经元兴奋性毒性损伤。大量针对缺血性脑卒中等不同神经系统疾病模型的临床前研究表明，抑制或阻断NMDAR能够有效减轻神经元的病理损伤。但是，NMDA受体拮抗剂的临床试验却常常由于无明确有效性或者不可耐受的副作用而失败。随着对NMDAR亚单位结构和功能多样性的深入认识，高选择性的干预NMDAR亚单位功能为开发治疗缺血性脑卒中的神经保护剂提供了新的思路。本课题组前期体内外动物实验和临床试验研究证实，人参皂苷Rd (GSRd)在急性缺血性脑卒中的治疗中具有良好的神经保护效应，提示GSRd可能成为一种具有应用前景的神经保护剂。但是其作用机制和靶点尚不明确。我们前期研究提示GSRd的神经保护作用可能与NMDAR有关。由于NMDAR在缺血性脑卒中的发病中具有重要作用，本研究在体外培养的大鼠海马神经元上，采用神经电生理学和分子生物学等方法，探讨了GSRd神经保护作用与NMDAR之间的关系。以期进一步揭示GSRd的作用机制及潜在靶点，为其临床应用提供理论依据。第一部分人参皂苷Rd对NMDA受体电流的调节作用目的：本课题前期研究提示GSRd的神经保护作用可能与NMDAR有关。因此，本部分实验首先探讨NMDAR是否为GSRd发挥神经保护作用的潜在靶点。方法：大鼠海马神经元原代培养至10-14d用于实验。采用膜片钳技术和“Y型管”给药系统，在无镁外液环境下记录大鼠海马神经元的NMDA受体电流，并给予GSRd和不同NMDA受体拮抗剂干预，观察GSRd对NMDA受体电流的影响。建立兴奋性毒性损伤模型，记录兴奋性毒性损伤情况下NMDA受体电流变化，并观察GSRd处理对该电流的影响。结果：1.在大鼠海马神经元上，给予NMDA刺激可迅速诱发出明显的内向电流，该电流具有快速部分脱敏的特点。给予NMDAR拮抗剂AP-5和MK-801均能够显著抑制该电流，表明我们记录到的是典型的NMDA受体电流。2. GSRd能够明显减小NMDA受体电流峰值，并且其作用具有剂量依赖性，其EC50为7.7μM。3.兴奋性毒性损伤后记录到的NMDA受体电流峰值较正常状态下诱发电流峰值明显增大，而给予GSRd处理后NMDA受体电流峰值较损伤组明显减小，表明在兴奋性毒性损伤情况下GSRd亦能够明显抑制NMDAR的活动。结论：GSRd在一定程度上能够减小NMDAR通道活动，并且在兴奋性毒性损伤情况下仍能够明显降低过度开放的通道活动，提示NMDAR可能是GSRd发挥神经保护作用的潜在靶点。第二部分人参皂苷Rd对NMDA受体调节作用的亚单位选择性目的：功能性NMDAR主要由两个NR1亚单位和两个NR2A或两个NR2B亚单位组成，研究表明NR2A和NR2B亚单位在突触内外的分布和功能是不同的。本部分实验中我们进一步分离NMDA受体电流成分，观察GSRd对NMDAR的调节作用是否具有亚单位选择性。方法：原代培养大鼠海马神经元至10-14d用于实验。采用膜片钳技术和“Y型管”给药系统在大鼠海马神经元上记录NMDA受体电流，分别给予NR2A亚单位选择性拮抗剂NVP-AAM077和NR2B亚单位选择性拮抗剂ifenprodil干预，观察它们是否影响GSRd对NMDA受体电流的调节作用。记录NMDA受体成分的微小突触后电流(NMDAR-mEPSC)以反映突触内NMDAR活动，按照MK-801抑制方案分离突触外NMDA受体电流，分别观察GSRd对二者的影响。在HEK293细胞上转入重组NR1/NR2A受体和NR1/NR2B受体，分别记录NR1/NR2A受体电流(INR1/NR2A)和NR1/NR2B受体电流(INR1/NR2B)，观察GSRd对这两种电流的影响。使用NMDAR放射性配基[3H]CGP39653进行配基受体结合实验，检测GSRd对NMDAR的亲和力。结果：1. NVP-AAM077并未影响GSRd对NMDA受体电流的抑制作用，而ifenprodil则能够完全消除GSRd对NMDA受体电流的抑制作用。2. GSRd处理前后海马神经元突触内NMDAR-mEPSC的频率和幅度均没有明显变化。但是GSRd能够明显减小突触外NMDA受体电流的峰值。3. GSRd对转染HEK293细胞INR1/NR2A和INR1/NR2B均无明显影响。GSRd对[3H]CGP39653特异性结合的抑制率较低，提示其与NMDAR的亲和力较低。结论：GSRd对NMDAR的调节作用具有一定的亚单位选择性，可能主要通过影响NR2B亚单位降低NMDAR通道活动。但是转染实验和结合实验结果提示，GSRd可能并非通过直接结合受体上的配基结合位点发挥效应，而可能是通过间接途径调节NMDAR活动。第三部分NR2B亚单位磷酸化参与人参皂苷Rd抵抗兴奋性毒性损伤的作用目的：NMDAR的NR2B亚单位具有较长的细胞内段，其上有多个磷酸化调节位点，对于NMDAR功能活动的调控具有不可或缺的作用。本部分实验主要探讨磷酸化调节是否参与GSRd减小NMDAR活动抵抗兴奋性毒性损伤的作用。方法：原代培养大鼠海马神经元至10-14d用于实验，采用膜片钳技术和“Y型管”给药系统在大鼠海马神经元上记录NMDA受体电流，给予不同激酶抑制剂处理，观察它们对GSRd减小NMDA受体电流效应的影响。建立兴奋性毒性损伤模型，并给予GSRd处理，进行western blot分析，检测NMDA受体NR2B亚单位总蛋白和磷酸化水平的变化；检测cleaved caspase-3的表达以及Akt和ERK的活性变化，反映神经元损伤和存活状况。结果：1. PKC抑制剂G6983能够阻断GSRd对NMDA受体电流的减小作用，而酪氨酸激酶Src抑制剂PP2和CaMKII抑制剂CK59对GSRd的作用均无影响。2.兴奋性毒性损伤以及给予GSRd处理后，NMDAR各亚单位的总蛋白表达均没有明显变化，NR2B亚单位Tyr1472和Ser1480位点的磷酸化水平亦没有明显变化。但是Ser1303位点的磷酸化水平在兴奋性毒性损伤后显著升高，而给予GSRd处理后，该位点磷酸化水平明显降低。3.兴奋性毒性损伤后cleaved caspase-3的表达明显增高，而给予GSRd处理后其表达水平显著降低。NMDA损伤后Akt和ERK的总蛋白水平没有明显变化，但磷酸化Akt和ERK水平明显降低，而给予GSRd干预损伤后，二者磷酸化水平较兴奋性毒性损伤组均有明显的恢复。结论：GSRd可能通过抑制NR2B亚单位的Ser1303位点磷酸化，调节NMDAR通道活动，从而减轻兴奋性毒性损伤，改善神经元的存活状态，这可能是GSRd发挥神经保护作用的重要通路。