小麦全蚀病是由禾顶囊壳真菌小麦变种Gaeumannomyces graminis var.tritici(Ggt)引起的一种小麦根部病害,是目前世界范围内最重要的小麦根部病害之一,在普通小麦中没有发现抗全蚀病或者对其免疫的品种。RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的能特异性降解同源mRNA的现象。本研究利用dsRNA介导的RNAi方法寻找与小麦全蚀病菌生长发育和致病有关的基因,构建了小麦全蚀病菌菌丝遗传转化效率较高的体系,为小麦全蚀病菌基因功能以及致病性的研究奠定了基础。主要研究内容及结论如下:1.本实验在探索过程中,对菌丝定量和菌丝培养介质进行选择,结果发现将病原菌菌丝打碎成细小片段大大提高了菌丝均一性,采用细胞培养板液体培养能给菌丝生长提供较好的干扰环境。2.通过对培养液中dsRNA添加浓度进行研究,对dsRNA(龙胆酸加双氧酶)浓度在50-500ng/μL范围进行菌丝抑制率分析,结果表明dsRNA浓度达到100 ng/μL时对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制作用较为明显,抑制率与对照相比有统计学差异。本研究对19个基因进行体外干扰,结果表明添加不同基因的dsRNA,菌丝所表现出来的干扰效果有所不同,其中细胞分裂控制蛋白,龙胆酸加双氧酶,ADP-ATP转位酶3种基因的dsRNA对菌丝生长的抑制作用较高,抑制率最高的达到8.5%,与对照相比具有统计学差异。这三种基因荧光定量PCR结果显示,体外添加dsRNA(100 ng/μL)后5天内这3种基因在菌丝体内的相对表达量均有明显降低,但表现出不同的变化趋势。表明体外添加dsRNA的方法能对菌丝体内的基因产生干扰作用,但这种干扰作用具有一定的不稳定性。3.通过对植物RNA干扰载体pFGC5941和真菌表达载体pBHt2-eGFP进行酶切、末端补平、连接,构建了真菌RNA干扰载体pBHt2-CHSA-Intron,用此载体可先在真菌体内验证基因干扰效果,效果明显的可通过酶切连接进植物RNA干扰载体pFGC5941中,再对植物进行转化,该载体为植物抗真菌研究提供了很大的方便。4.本研究采用菌丝与农杆菌共培养的方法,对小麦全蚀病菌菌丝进行遗传转化,在培养体系中农杆菌用量,共培养时间,共培养时培养基中As浓度,溶壁酶处理前后对转化效率的影响方面进行研究,建立了高效转化小麦全蚀病菌菌丝的体系。研究结果表明,在共培养时间为3天,农杆菌用量为300μl(OD=0.35),共培养培养基中As浓度为400μmol/L时,转化效率最高。经溶壁酶处理(500 U/mL)后菌丝转化效率增高,且溶壁酶处理菌丝6 h后再进行菌丝的遗传转化时转化效率约为10%,比未经溶壁酶处理的菌丝转化效率提高约一半。转化子经过5代转接后仍能在含潮霉素B的培养基上稳定生长,说明转化子T-DNA已经插入到小麦全蚀病菌染色体上,且能稳定遗传。