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目的:宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）的持续感染密切相关,因此可以通过应用阻止HPV感染的预防性疫苗及清除原有HPV感染、HPV感染相关宫颈癌的治疗性疫苗,最终达到防治宫颈癌的目的。虽然预防性HPV疫苗在未感染HPV的人群中接种显示出良好的安全性和有效性,但对由HPV持续感染诱发的宫颈癌患者无治疗作用。由于目前尚无批准上市的治疗性疫苗,因此开发安全有效的治疗性HPV疫苗显得尤为重要。治疗性疫苗旨在通过诱导强有力的肿瘤特异性Th1型及细胞毒性T淋巴细胞免疫应答,进而清除HPV感染及HPV恶性转化的肿瘤细胞。尽管在临床前研究中报道了一系列能够抑制或清除皮下肿瘤的候选疫苗,但这些疫苗在临床研究中却并未达到令人满意的治疗效果。我们推测治疗性疫苗临床疗效较差可能与肿瘤进展相关的免疫抑制性微环境,以及免疫抑制细胞诱导的效应细胞功能的抑制相关。另一个原因可能是在临床前研究中,用于评估治疗性HPV疫苗疗效的最常用的模型是将TC-1等肿瘤细胞接种到小鼠皮下而建立的宫颈癌异位肿瘤模型,而患者的HPV相关的肿瘤通常发生在生殖器黏膜,异位模型无法准确地模拟宫颈癌患者疾病发生部位的条件。在本研究中,我们通过将肿瘤细胞悬液原位植入子宫颈附近的粘膜下层来模拟肿瘤发生的部位,建立原位宫颈癌模型,通过皮下注射途径接种以Cp G ODN为佐剂的HPV 16 E7多肽疫苗,研究该途径接种疫苗对宫颈癌局部免疫应答的影响,明确疫苗对宫颈原位肿瘤生长的作用及机制。脂质体和脂质体衍生的纳米囊泡既能诱导抗原特异性的体液免疫应答,又能诱导抗原特异性的细胞免疫应答,被认为是优良的疫苗递送载体/佐剂。由于其自身的封闭结构,脂质体可以将疏水剂包裹在脂质双层中,而将亲水剂包裹在水性隔室中,既保护了所装载的药物,又避免了不良暴露和环境对药物的降解作用。甘露糖修饰的脂质体可以特异性地靶向树突细胞（Dendritic cell,DC）上的甘露糖受体,从而增强DC介导的抗肿瘤活性。为了有效地靶向和激活DC,本研究应用靶向树突细胞的甘露糖修饰的脂质体作为递送载体,首次构建了载有HPV16 E7多肽和佐剂Cp G ODN的全新疫苗Lip E7/Cp G,在肿瘤体积超过200mm3的局部晚期宫颈癌小鼠模型中评估了接种该疫苗后的治疗效果,通过免疫学检测揭示了该制剂诱导的抗肿瘤反应背后的机制。研究方法:1.应用荷宫颈癌的C57BL/6小鼠研究以Cp G ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗对宫颈癌的治疗作用:采用6-8周C57BL/6小鼠,通过将TC-1细胞直接注入子宫颈附近的阴道黏膜下层来模拟原位宫颈癌的发生,建立小鼠原位宫颈癌模型。C57BL/6小鼠接种TC-1细胞后第4天,皮下注射以Cp G ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗、单独的佐剂Cp G组及单独的E7多肽组,PBS组作为对照。每日对小鼠及肿瘤的生长状况进行观察,记录小鼠体重、肿瘤体积和生存期等,分析以Cp G ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗对小鼠肿瘤生长的抑制作用。2.研究以Cp G ODN为佐剂的HPV16 E7多肽疫苗对小鼠宫颈局部肿瘤微环境的影响:应用流式细胞术研究以Cp G ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗对C57BL/6小鼠宫颈局部肿瘤微环境中CD4+T细胞、CD8+T细胞、IFN-γ+T细胞、Treg、MDSCs及TAMs等细胞的影响;应用q RT-PCR研究肿瘤组织中的细胞因子、趋化因子、MMPs等表达水平;应用免疫组织化学法研究肿瘤组织中的凋亡、侵袭、血管形成、胶原分布等。3.制备负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗,利用透射电镜观察甘露糖修饰的脂质体疫苗形态,利用激光粒度分析仪在水中测量脂质体疫苗的粒度分布和zeta电位。4.应用荷宫颈癌的小鼠,研究负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗对晚期宫颈癌的治疗作用:6-8周C57BL/6小鼠接种5×105 TC-1细胞,接种肿瘤细胞后第12天,当平均肿瘤大小超过200mm3时,皮下注射脂质体疫苗、空脂质体组、游离的E7多肽与佐剂Cp G ODN联合疫苗组,PBS组作为对照组。每天对小鼠及肿瘤的生长状况进行观察,并且对小鼠体重、肿瘤体积和生存期等做好相关记录,分析脂质体疫苗对小鼠肿瘤生长的抑制作用。5.研究负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗对小鼠系统免疫应答的影响:应用流式细胞术研究脂质体疫苗对小鼠产生特异性细胞免疫应答的影响,包括对CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞、Treg、MDSC、TAM等免疫细胞的影响,以及脂质体疫苗接种后诱导的体内CTL反应。6.研究负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗对小鼠肿瘤微环境的影响:应用q RT-PCR研究肿瘤组织中的细胞因子、趋化因子、MMP等表达水平;应用免疫组织化学法研究肿瘤组织中的凋亡、侵袭、血管形成、胶原分布等。结果:1.成功建立小鼠原位宫颈癌模型,接种以Cp G ODN为佐剂的HPV E7多肽疫苗能够显著增强小鼠适应性免疫应答,增强对肿瘤细胞的杀伤作用,有效抑制小鼠原位宫颈癌生长,并延长小鼠生存时间。2.小鼠接种以Cp G ODN为佐剂的HPV E7多肽疫苗后,宫颈肿瘤局部CD4+T细胞（P<0.05）、CD8+T细胞（P<0.001）百分比显著升高,宫颈癌肿瘤微环境中的MDSC细胞（P<0.05）数量显著降低。q RT-PCR结果显示肿瘤组织内IL-2（P<0.05）表达水平显著升高,而IL-4（P<0.001）、TGF-β（P<0.05）等免疫抑制细胞因子表达水平显著降低,CCL-1（P<0.001）、CCL-2（P<0.001）、CCL-3（P<0.001）、CCL-5（P<0.001）、CCL-12（P<0.001）、CCL-21（P<0.001）等趋化因子表达水平显著降低,MMP-2（P<0.001）、MMP-3（P<0.001）、MMP-9（P<0.001）等基质金属蛋白酶表达水平显著降低。免疫组织化学分析结果显示,当用以Cp G ODN为佐剂的HPV E7多肽疫苗免疫小鼠时,肿瘤组织中的α-SMA（P<0.001）、Ki67（P<0.05）和p53（P<0.001）等蛋白的表达水平显著降低。总之,接种以Cp G ODN为佐剂的HPV E7多肽疫苗,能显著增强抗肿瘤免疫应答,逆转肿瘤相关免疫抑制,改善肿瘤免疫疗法的功效。3.成功制备负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗,脂质体粒径在60-120 nm范围内,呈球形,表面带负电荷。4.负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗通过靶向树突细胞并促进其成熟,最终达到有效抑制荷瘤小鼠肿瘤生长并延长其生存时间的结果。5.小鼠接种负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗后,脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞（P<0.01）、CD8+IFN-γ+T细胞（P<0.05）占比明显升高,脾脏中MDSCs（P<0.001）、TAMs（P<0.01）等免疫抑制细胞百分比显著降低。此外,负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗能诱导有效的E7特异性体内CTL反应。6.q RT-PCR结果显示,疫苗组小鼠肿瘤组织内IL-2（P<0.001）、IL-12（P<0.001）、INF-γ（P<0.001）、TNF-α（P<0.001）等抗肿瘤细胞因子表达水平显著升高,而IL-4（P<0.001）和TGF-β（P<0.001）等免疫抑制细胞因子表达水平显著降低。趋化因子方面,疫苗组小鼠肿瘤组织内CCL-3（P<0.001）、CXCL-9（P<0.01）和CXCL-10（P<0.001）等趋化因子表达水平显著增加。免疫组化染色分析结果表明,当用负载人乳头瘤病毒16型E7多肽和佐剂Cp G ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗免疫小鼠时,肿瘤组织中的血管生成数目明显减少（P<0.001）、Ki67（P<0.001）和p53（P<0.01）的表达水平明显降低。结论:1.皮下注射以Cp G ODN为佐剂的HPV16 E7多肽疫苗通过增加小鼠宫颈肿瘤局部浸润的CD4+T与CD8+T细胞数量,降低MDSC的数量,增加荷瘤小鼠分泌IL-2,抑制IL-4、TGF-β等免疫抑制细胞因子及MMP-2、MMP-3、MMP-9等基质金属蛋白酶表达,有效抑制荷瘤小鼠宫颈原位肿瘤生长。2.应用靶向树突细胞的甘露糖修饰的脂质体作为疫苗递送载体,首次构建了载有佐剂Cp G ODN和HPV16 E7多肽的全新疫苗Lip E7/Cp G;Lip E7/Cp G通过增强细胞免疫应答,改善肿瘤组织内免疫抑制微环境,显著抑制局部晚期宫颈癌的生长。