目的:牙髓和牙本质在组织学发生上都来自于牙胚的牙乳头,对外界刺激的应答有互联效应,是一个生物整体,即牙髓牙本质复合体。成牙本质细胞（odontoblasts）是牙齿发育中最重要的细胞,大量研究表明当外界刺激导致成牙本质细胞受损时,牙髓中的牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）可以增殖分化为有分泌功能的成牙本质细胞,参与牙髓牙本质的修复再生过程。因此,寻求合适的信号因子诱导DPSCs的成牙本质向分化是实现牙髓牙本质复合体再生的关键一步。釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）是牙齿发育矿化过程中的一个重要上皮信号,它是由成釉器及上皮根鞘分泌的一种蛋白质混合物。在牙冠部发育过程中,主要调节釉质的矿化和成熟;在牙根部发育过程中,EMPs被合成和分泌来诱导邻近的间充质细胞分化为成牙本质细胞形成牙本质,以及成牙骨质细胞形成牙骨质。因此,EMPs在牙齿发育过程中的作用贯穿始终,是诱导牙源性干细胞成牙本质向分化的重要上皮信号。其组成成分复杂,包含釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白、蛋白酶和TGF-β1、BMP-2等多种生长因子类物质等。目前主要从猪发育中牙胚提取EMPs,即釉基质蛋白衍生物（enamel matrix derivative,EMD）,国外已推出商品化的EMD（商品名Emdogain（?））并实际应用于临床牙周组织再生及牙种植等治疗中。已有大量研究证实EMD可以促进牙周膜干细胞、成骨细胞、牙龈间充质干细胞等牙周来源细胞的增殖、分化以及牙周软硬组织再生。将EMD用于牙周组织再生已获得较为成熟的经验,但其在牙体牙髓领域的应用尚处于起始和发展阶段。迄今为止,仅有少量体外研究探讨其作为辅助盖髓材料和促进釉质再矿化的潜能,而EMD能否促进DPSCs在体内外的成牙本质向分化以及其影响DPSCs分化的作用机制尚未见报道。为研究EMD对DPSCs体内成牙本质向分化的影响,需要一个理想的细胞载体来为DPSCs的黏附、增殖和分化创造一个功能性和优化的微环境。Vitro Gel 3D-RGD是一种无动物源性的多糖水凝胶体系,可模拟天然细胞外基质环境,作为可注射型水凝胶具有较高的孔隙率和良好的生物相容性,并且可注射用于体内研究,已验证支持多种细胞类型的3D培养。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号转导通路是介导细胞增殖和成骨/成牙分化的重要途径之一。已有大量研究证实了MAPK信号通路在DPSCs成牙本质向分化过程中的重要调控作用。据报道,BMP-2、MTA和Biodentine都可诱导DPSCs向成牙本质细胞分化,而三者皆是通过MAPK信号通路发挥的作用,但该通路是否参与调控EMD诱导的DPSCs成牙本质向分化过程尚不清楚。鉴于EMD是在牙齿发育过程中激活和调控成牙本质向分化的重要上皮信号,我们推测EMD可能重启上皮-间充质相互作用,从而促进DPSCs的成牙本质向分化。本研究拟探讨EMD对DPSCs体外成牙本质向分化和增殖活力的影响,并在体内结合Vitro Gel 3D-RGD水凝胶观察EMD在体内促进DPSCs成牙本质向分化的再生潜能,随后初步探索MAPK信号通路在EMD诱导DPSCs牙向分化过程中的作用,为将EMD应用于牙髓及根尖周疾病的生物治疗提供理论依据。研究方法:1、人牙髓干细胞（DPSCs）的分离鉴定和EMD对其细胞活力的影响1.1常规从人健康牙髓分离培养出原代牙髓细胞,进一步通过有限稀释法纯化出DPSCs。1.2流式细胞术检测干细胞表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146和STRO-1的表达;免疫荧光染色检测细胞表面抗原CD105、CD146和STRO-1的表达。1.3将DPSCs经成骨/成牙向分化诱导14天后,通过茜素红染色观察矿化结节的生成;将DPSCs经成脂向分化诱导21天后,通过油红O染色观察脂滴形成情况以鉴定DPSCs的多向分化潜能。1.4将25、50和100μg/mL EMD分别作用于DPSCs 1、3、5、7和9天后,采用CCK-8细胞活力检测法研究EMD对DPSCs细胞活力的影响。2、EMD对DPSCs成牙本质向分化影响的体外、体内研究2.1将25、50和100μg/mL EMD作用于DPSCs 3、7和14天后进行ALP活性检测,并于第7天进行ALP染色来观察EMD对DPSCs的ALP活性的影响。2.2通过茜素红染色和定量试验检测了50和100μg/mL EMD对DPSCs第14天矿化结节生成的影响,以筛选EMD作用的最佳浓度用于后续实验。2.3分别在100μg/mL EMD处理DPSCs第3、7和14天通过Real-time RT-PCR检测成牙本质向分化相关基因RUNX2、ALP、BSP、DSPP、DMP1和OCN的mRNA表达水平。2.4在100μg/mL EMD处理DPSCs第3天和第14天通过Western blot检测RUNX2、ALP、BSP、DSPP、DMP1和OCN的蛋白水平表达变化。2.5使用Vitro Gel 3D-RGD水凝胶3D培养DPSCs,并于第3和第7天通过扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶的微观结构特征以及DPSCs在其中黏附、生长的情况。2.6通过异位皮下注射动物实验在体内以Vitro Gel 3D-RGD水凝胶作为可注射支架观察EMD对DPSCs体内成牙本质向分化的影响,手术6周后取材进行观察。2.7通过HE染色、Masson三色染色和DSPP、OCN免疫组化染色观察EMD对DPSCs体内成牙本质向分化的影响。2.8通过CD31免疫组化染色观察EMD对DPSCs体内成血管向分化的影响,以及Von Kossa染色观察EMD对DPSCs体内矿化硬组织生成的影响。3、MAPK信号通路在EMD诱导的DPSCs成牙本质向分化过程中的作用3.1以100μg/mL EMD分别刺激DPSCs 5、10、30、60和120min后,Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。3.2添加JNK、p38和ERK信号通路特异性抑制剂SP600125、SB203580和U0126,通过Western blot检测单独抑制剂以及与EMD联用对各自通路蛋白磷酸化水平的影响。3.3使用SP600125、SB203580和U0126抑制剂分别阻断JNK、p38和ERK信号通路后,Western blot检测EMD诱导DPSCs 7天后RUNX2、ALP、BSP、DSPP、DMP1和OCN的蛋白表达水平。3.4阻断JNK、p38和ERK信号通路后,通过ALP染色和ALP活性检测观察EMD诱导7天后DPSCs的ALP活性。3.5阻断JNK、p38和ERK信号通路后,通过茜素红染色及定量检测EMD诱导14天后DPSCs的矿化结节生成。结果:一、DPSCs的鉴定及EMD对其细胞活力的影响1、从人健康牙髓分离提取并纯化得到的DPSCs阳性表达间充质干细胞表面标记CD29、CD90、CD105、CD146和STRO-1,且不表达造血干细胞表面抗原CD34和CD45;DPSCs经过成骨/成牙诱导14天后茜素红染色可见矿化结节生成;经成脂诱导21天后油红O染色可见红色脂滴形成。2、25、50和100μg/mL的EMD对DPSCs的细胞活力均没有明显的影响,各EMD实验组与对照组的DPSCs活力在第1、3、5、7、9天时间点均无统计学差异。二、EMD对DPSCs体外成牙本质向分化的影响1、50μg/mL和100μg/mL EMD可以显著增强DPSCs的ALP活性,且100μg/mL EMD组的ALP活性在第3和14天显著高于50μg/mL组;25μg/mL EMD对DPSCs的ALP活性无明显影响。2、50μg/mL和100μg/mL EMD同样可以促进DPSCs的矿化结节形成,且100μg/mL EMD的促进效果显著优于50μg/mL,故筛选出100μg/mL作为EMD的最适浓度用于后续实验。3、100μg/mL EMD可以增强第3天RUNX2、ALP和BSP,第7天BSP以及第14天DSPP、DMP1和OCN的mRNA表达水平,同样可以促进第3天RUNX2、ALP、BSP、DMP1和OCN以及第14天RUNX2、ALP、DSPP、DMP1和OCN的蛋白表达水平。三、EMD对DPSCs体内成牙本质向分化的影响1、用Vitro Gel 3D-RGD水凝胶3D培养DPSCs,通过SEM观察到Vitro Gel 3D-RGD微观呈现为大量均一并高度相互连通的网孔结构,并且DPSCs在其中生长表现出良好的黏附和增殖趋势。2、体内注射6周后的再生组织HE染色结果显示EMD可促进胶原纤维沉积和基质矿化;Masson染色显示EMD组与对照组相比形成更多牙本质样基质和新生血管;DSPP和OCN蛋白免疫组化染色结果显示EMD组与对照组相比可见大量的DSPP和OCN阳性着色区域。3、体内注射6周后的再生组织CD31免疫组化染色显示EMD组由CD31阳性细胞包围的血管腔数量明显高于对照组;Von Kossa染色显示EMD组与对照组相比可见大量黑色矿化组织沉积。四、EMD通过MAPK信号通路促进DPSCs的成牙本质向分化1、p-JNK和p-ERK1/2蛋白表达在EMD刺激10min内上调并到达顶峰,而p‐p38 MAPK蛋白表达在EMD刺激5min内就迅速上升到达峰值,提示EMD可以激活DPSCs的JNK、p38和ERK信号通路。2、特异性抑制剂SP600125、SB203580和U0126可分别阻断JNK、p38和ERK信号通路,并且显著抑制了EMD原本对p-JNK、p-p38 MAPK和p-ERK蛋白表达水平的上调。3、阻断JNK、p38和ERK通路后抑制了EMD原本对DPSCs成牙本质向分化相关标志物RUNX2、ALP、BSP、DSPP、DMP1和OCN蛋白表达水平的上调。4、抑制剂SP600125、SB203580和U0126可以逆转EMD对DPSCs的ALP活性增强以及矿化结节沉积的增多。结论:1、EMD不会对DPSCs的细胞活力产生影响,但可在体外促进DPSCs的成牙本质向分化。2、EMD可在体内促进DPSCs的成牙本质向分化、成血管向分化以及矿化硬组织生成。3、阻断JNK、p38和ERK信号通路抑制了EMD增强的DPSCs成牙本质向分化,说明MAPK信号通路是EMD促进DPSCs牙向分化的调控途径之一。