痘病毒(Poxvirus)是一类基因组较大的有包膜的线性双链DNA病毒,包括天花病毒(Variola virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)和牛痘病毒(Cowpox virus)等。其具有非必需基因多,对外源基因的容量大(<25kbp)及胞质复制等特点,因此痘苗病毒或者其它类型痘病毒能够以载体的形式用于抵抗流感病毒(Influenza virus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)等的疫苗构建;更重要的是,通过敲除痘苗病毒特定基因,使其具有肿瘤选择性和安全性,因此可以作为溶瘤病毒的载体成为肿瘤免疫治疗的新手段。以往的研究中获得重组痘苗病毒载体的主要方法包括传统同源重组、直接体外连接法、细菌人工染色体等。但是这些方法存在重组效率低,病毒纯化耗时长等弊端,严重阻碍了痘苗病毒载体在临床上的应用,因此,目前亟需高效重组痘苗病毒载体的技术方法。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 是一种gRNA引导Cas9蛋白对靶点切割的基因编辑技术,可以产生indel;同时也可以在提供携带病毒同源序列的重组质粒的基础上,产生同源重组,获得新的重组病毒,已成功用于哺乳动物细胞及多种病毒、细菌的基因编辑中。而痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)是中国自主研发、世界卫生组织文献记载中成功用于预防天花的疫苗毒株,在消灭天花的过程中发挥了重要的作用,已作为中国防止天花再次出现的应急储备疫苗毒种。因此,本研究拟在痘苗病毒天坛株的基础上通过CRISPR-Cas9建立高效重组痘苗病毒载体系统。本研究首先对痘苗病毒基因组进行扫描分析,利用网站(http://www.e-crisp.o-rg/E-CRISP/)预测靶向痘苗病毒不同位点的多条gRNA,后续选择了 TK区进行高效重组技术方法的探索。为此,本研究通过瞬时转染gRNA-Cas9质粒或建立表达Cas9蛋白的稳定细胞系后,感染VTT并转入重组质粒pJ2R-EGFP,经过多轮病毒噬斑实验纯化、测序鉴定证明利用CRISPR-Cas9技术能够更高效率的获得重组病毒天坛株痘苗病毒载体。同时与传统的同源重组方法相比,此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率大大提高,据此本研究初步建立起高效重组痘苗病毒载体系统。在高效重组痘苗病毒载体系统的建立过程中,为便于筛选,引入了外源筛选标记基因。为了满足重组痘苗病毒实际应用的需要,需要删除重组病毒中的筛选标记。Cre-LoxP是一种利用Cre酶识别特异DNA序列(LoxP位点),使两个Loxp位点间发生多种形式基因重组的系统。据此,本实验构建带有LoxP位点的重组质粒,利用瞬时转染高效重组的方法获得带有LoxP位点的重组病毒,然后通过Cre酶删除重组病毒中的筛选标记,获得删除TK且无筛选标记EGFP的重组痘苗病毒载体。综上所述,本研究通过CRISPR-Cas9与Cre-LoxP技术建立起高效重组且无筛选标记的痘苗病毒天坛株载体系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。