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Bt毒素是防治农业害虫的重要的生物农药。当利用转Bt基因棉花进行害虫治理时,化学农药已经有很大程度的减少,同时某些昆虫也出现了对Bt的抗性,对农业生产产生严重的威胁。目前,Bt毒素的作用机理和抗性机制还不是很清楚。
CrylAb和CrylAc毒素都能结合棉铃虫中肠上皮细胞的钙粘蛋白(Cadherin-like protein)和氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN),目前,CrylA毒素与中肠上受体的作用机制还不是很清楚,为了进一步了解毒素与中肠受体之间的相互作用,在本论文中,利用免疫组织化学的方法分析了钙粘蛋白在中肠上皮细胞的组织水平上的定位,并比较了敏感品系和抗性品系的棉铃虫中肠上皮钙粘蛋白的免疫定位。此外,通过大肠杆菌表达的不同长度的氨肽酶N片段,利用Western blot技术来确定CrylAb毒素在结合区的定位。利用高碘酸氧化的方法确定氨肽酶N的糖基化对其与CrylAb和CrylAc毒素结合的影响。
主要结果如下:钙粘蛋白是位于中肠上皮细胞的微绒毛的顶部,并且在整个中肠均匀分布,在中肠上皮的底膜也有分布。此外,在细胞质中有微弱的染色,这表明钙粘蛋白在细胞质的反面内质网上合成后,向微绒毛的顶端动态运输。从棉铃虫敏感品系和抗性品系的免疫组织定位来看,钙粘蛋白的免疫定位并没有显著的变化。这种分布模式也表明,毒素必须穿过围食膜,然后才与钙粘蛋白结合。同时也表明钙粘蛋白的这种分布模式与Bt毒素的作用机制是一致的。不同长度的原核表达重组氨肽酶N片段与CrylAb毒素杂交表明,至少存在有2个结合区,其中的一个结合区位于1 Met——329 Leu,而另一个结合区位于396 Val——517 Ala。通过分析APN氨基酸序列发现这两个结合区都不包含“锌结合位点<375>ILSHEIAHMW<384>”,这表明毒素结合APN是不依赖这种“锌结合位点”结构。大豆凝集素SBA杂交与配基杂交实验表明,N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)共价偶联在120 kDa的APN上,高碘酸氧化处理杂交膜实验表明,GaINAc是CrylAc毒素识别APN的表位,而CrylAb毒素不识别APN上的GalNAc。