论文部分内容阅读
蜘蛛丝是自然界具有最优异力学性能的生物纤维,主要成分为蛛丝蛋白,但是难以大量生产或收集。利用基因工程手段可实现蛛丝蛋白基因转入异源宿主中并表达。本实验通过脂质体转染法将蜘蛛牵丝蛋白基因真核表达载体pK-2S转入美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中,筛选稳定转入蛛丝蛋白基因的细胞株,通过DNA,RNA水平的检测初步鉴定基因是否转入细胞并表达,为培育能生产含有蛛丝蛋白羊毛的绵羊新品种奠定基础。主要结果如下：1.以已发表的棒络新妇蛛cDNA片段为模板,人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S),并获得二聚体(2S)。2.建立了新疆美利奴细毛羊胎儿成纤维细胞系,细胞形态观察显示细胞形态良好,生长曲线表明细胞增殖状态较好,核型分析正常。3.克隆了绵羊毛囊特异性表达启动子Kap6.1,构建表达载体pKap-EGFP并转入细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中并表达绿色荧光蛋白,表明启动子具有表达活性。4.以pEGFP-N1为框架,将2S与绵羊毛囊特异性启动子Kap6.1相连,构建毛囊特异表达载体pK-2S。5.质粒pK-2S线性化后,转染新疆美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞,并通过600μg/mL G418筛选单克隆。提取单克隆基因组进行PCR验证,表明了部分克隆转入蛛丝蛋白基因,对部分阳性克隆提取细胞总RNA进行RT-PCR,并以cDNA为模板进行PCR验证,表明蛛丝蛋白在RNA水平表达。