第一章ADMA在AngⅡ诱导的内皮细胞炎症反应中的作用及机制探讨目的：内源性的NOS抑制物如非对称性二甲基精氨酸（ADMA）可诱导“NOS脱偶联”，增加氧自由基生成，参与促AS发生发展的炎症反应过程。有小型临床研究提示，肾素-血管紧张素系统（RAS）的激活可能促进ADMA的生成，而使用ACEI或AT₁受体拮抗剂可使血浆中升高的ADMA水平下降，然而ADMA与血管紧张素（AngⅡ）的关系尚不明确。因此本课题拟在细胞水平直接观察AngⅡ是否促进ADMA的生成，并进一步探讨ADMA在AngⅡ诱导的血管内皮炎症反应过程中所起的作用及可能的机制。方法：用不同浓度的AngⅡ(10^-9，10^-8，10^-7，10^-6 M)培养人脐静脉内皮细胞不同时间（6-48 h）诱导内皮细胞活化，并加入不同浓度的氯沙坦（1，3，10μM）预处理1 h或L-精氨酸（0.5 mM）预处理1.5 h。为探讨ADMA在AngⅡ诱导的内皮细胞损伤中的作用，实验中加入外源性的ADMA（30μM，4或24 h）。检测细胞培养上清液中的ADMA（HPLC法）、NO（Giess法）、细胞内活性氧（ROS）水平和单核内皮细胞粘附。Elisa法测定上清液中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-8（IL-8）水平。采用RT-PCR法检测内皮细胞上IL-8受体CXCR₂mRNA表达，采用Western Blot法检测内皮细胞ADMA合成酶蛋白甲基转移酶（PRMT）的蛋白表达，采用HPLC法检测ADMA水解酶二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）活性以及EMSA法检测细胞内核转录因子（NF-κB）活性。结果：1．AngⅡ(10^-9-10^-6 M)培养内皮细胞24 h呈浓度依赖性地增加细胞PRMT的蛋白表达。10^-6 M的AngⅡ培养内皮细胞6 h，PRMT蛋白表达不明显，但AngⅡ培养细胞12，24，48 h均能显著增加PRMT的蛋白表达，以24 h作用最明显。同时AngⅡ显著降低内皮细胞DDAH活性，升高上清液中ADMA水平。2．AngⅡ(10^-6 M)培养内皮细胞24 h后明显降低NO的生成，激活NF-κB，显著增加上清液中IL-8、TNF-α水平，增加内皮单核细胞间粘附。AngⅡ(10^-6 M)培养内皮细胞4 h可升高细胞内ROS水平，上调IL-8受体CXCR₂ mRNA表达。氯沙坦呈剂量依赖性地抑制AngⅡ所致的上述效应。预先给与0.5 mM的NO供体L-精氨酸也诱导了类似的内皮保护效应。3．ADMA（30μM）培养内皮细胞24 h后明显抑制NO的生成，升高细胞内ROS水平，激活NF-κB通路，增加培养上清液中IL-8、TNF-α水平，增加内皮单核细胞间粘附。ADMA孵育内皮细胞4 h可上调CXCR₂ mRNA表达。预先给与氯沙坦或L-精氨酸可逆转ADMA对内皮细胞的损伤作用。结论：1．首次证实AngⅡ可升高内皮细胞培养液中ADMA水平，其机制与上调PRMT蛋白表达和降低DDAH活性有关。2．ADMA诱导氧化应激，激活NF-κB，上调趋化因子受体CXCR₂ mRNA表达，促进内皮单核细胞间粘附。3．氯沙坦抑制内源性和外源性的ADMA诱导的氧化应激和炎症反应，提示ADMA参与了AngⅡ诱导的内皮炎症反应。第二章ADMA对单核细胞趋化活性的影响及机制探讨目的：新近研究显示，在培养的内皮细胞，ADMA可增加MCP-1表达，促进内皮细胞与单核细胞粘附。但ADMA是否可直接活化单核细胞促进其粘附尚未见报道。在前一章已证实AngⅡ可诱导内皮细胞ADMA生成增加，然而单核细胞是否也存在ADMA的合成和降解系统，以及AngⅡ是否也能诱导单核细胞发生类似的反应促进AS的发展都不清楚，值得进一步探讨。故本课题选用单核细胞株，观察AngⅡ是否可促进ADMA生成，并进一步探讨ADMA促进单核细胞活化的分子机制。方法：用10^-6 M的AngⅡ或30μM的ADMA培养单核细胞4或24 h，不加或加入氯沙坦（1，3，10μM）预处理1 h或NF-κB抑制剂PDTC（10μM）预处理1.5 h。离心收集细胞培养上清液，检测ADMA（HPLC法）、MCP-1、IL-8、TNF-α（Elisa法）含量，细胞内ROS水平，单核细胞对内皮细胞的粘附。采用RT-PCR法检测IL-8受体CXCR₂和MCP-1受体CCR₂ mRNA表达，Western Blot检测单核细胞是否存在ADMA合成酶PRMT及其变化，同时检测细胞内DDAH活性和核因子NF-κB和活化蛋白-1（AP-1）（EMSA法）活性。结果：1．单核细胞和内皮细胞一样也存在ADMA的合成和降解酶系。10^-6 M的AngⅡ刺激单核细胞24 h显著增加PRMT的蛋白表达，降低DDAH活性，增加培养上清液中ADMA的含量。氯沙坦和PDTC均可通过降低PRMT蛋白表达和恢复DDAH活性，抑制AngⅡ对ADMA的升高作用。2．AngⅡ(10^-6 M)孵育单核细胞4或24 h后显著增加细胞内ROS生成和上清液中MCP-1、IL-8和TNF-α水平。AngⅡ孵育单核细胞可同时活化核因子NF-κB和AP-1，明显上调趋化因子受体CXCR₂和CCR₂ mRNA表达，促进单核细胞粘附到内皮细胞。预先给予氯沙坦呈浓度依赖性的抑制AngⅡ诱导的上述反应，抑制单核细胞的活化，抗氧化剂PDTC抑制AngⅡ诱导的氧化应激，抑制单核细胞粘附。3．ADMA（30μM）培养单核细胞4或24 h能显著增加细胞内ROS水平，升高培养上清液中MCP-1、IL-8和TNF-α含量，活化NF-κB和AP-1，上调趋化因子受体CXCR₂和CCR₂ mRNA表达，促进单核细胞和内皮细胞间粘附。预先给与氯沙坦或PDTC可逆转ADMA对单核细胞的活化作用，降低单核细胞粘附。结论：1．首次证实单核细胞上存在ADMA的合成酶PRMT和水解酶DDAH系统。2．AngⅡ增加单核细胞培养液ADMA水平，其机制与增加单核细胞PRMT蛋白表达和抑制DDAH活性有关。3．ADMA通过上调单核细胞趋化因子受体表达诱导单核细胞粘附，其机制涉及ROS／NF-κB／AP-1途径。4．氯沙坦抑制内源性或外源性的ADMA诱导的单核细胞活化，说明ADMA参与了AngⅡ诱导的单核细胞粘附。第三章ADMA对原发性高血压患者外周血单核细胞趋化因子受体表达的影响目的：血管内皮功能不全和单核细胞粘附到受损的血管内皮是心血管疾病血管病变发生的关键环节。在前两章，分别观察了ADMA在内皮细胞损伤和单核细胞活化中的作用，本章拟从整体水平检测原发性高血压患者血管内皮功能和单核细胞活性，并观察ADMA在其中所起的作用。方法：自2005年8月～2006年5月在湘雅医院门诊和住院部收集42名原发性高血压患者（未服用降压药物的初诊患者）和40名门诊健康体检者。应用高分辨率彩色B超检测肱动脉血流介导舒张功能（FMD），采用HPLC法检测血浆中ADMA含量，Griess法间接测定血浆中NO水平，采用ELISA法检测血浆中MCP-1、IL-8、TNF-α、vWF浓度。并采用梯度离心法分离外周血单个核细胞，贴壁后收集单核细胞，加入外源性的ADMA（30μM）孵育24 h后，用RT-PCR检测外周血单核细胞上CXCR₂ mRNA表达，用流式细胞仪检测外周血单核细胞上CCR₂蛋白表达。结果：1．原发性高血压患者血浆中ADMA水平升高（P＜0.05），血浆中NO水平下降（P＜0.05），同时伴有血管内皮功能障碍，表现为肱动脉FMD明显下降和vWF（内皮功能不全的标志因子）浓度显著升高（P＜0.01）。2．高血压患者血中一系列的炎症介质MCP-1、IL-8、TNF-α水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。3．原发性高血压患者分离的外周血单核细胞上CXCR₂ mRNA表达高于健康对照组，ADMA（30μM）培养24 h后可进一步上调CXCR₂ mRNA表达。流式细胞仪结果发现原发性高血压患者外周血单核细胞上CCR₂蛋白表达高于健康对照组，ADMA（30μM）处理24 h后CCR₂的蛋白表达更加明显。结论：1．原发性高血压患者存在内皮功能不全和外周血单核细胞活化。2．原发性高血压患者外周血单核细胞趋化因子受体CXCR₂和CCR₂表达上调，ADMA可进一步上调其表达。3．原发性高血压患者体内存在的血管内皮受损和单核细胞活化可能是促进AS发生的重要因素。