FABP3（fatty acid binding protein-3），又称心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fattyacid binding protein），定位于染色体1p33-p32，mRNA长度1097bp，含有4个外显子，编码由133个氨基酸组成的蛋白质，属于细胞内脂肪酸结合蛋白（intracellular lipid binding proteins，iLBPs）亚家族成员[1]。前期研究中，本研究小组应用抑制性差减杂交技术（suppression subtractivehybridization，SSH），分析室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）患者心室肌组织基因表达谱与正常人之间的差异，发现了诸多差异表达基因[2]。其中，FABP3基因差异高表达于VSD患者的心室肌组织中，提示FABP3可能与先天性心脏病的发生有关。前期研究已证实[3]，在P19细胞向心肌细胞分化过程中，FABP3基因mRNA和蛋白的表达水平随细胞分化呈现下调后再逐渐上调的表达模式，进一步研究则发现FABP3基因过表达不但能够抑制P19细胞向心肌细胞的分化，而且也能显著抑制P19细胞的增殖、显著诱导细胞凋亡[3]。因此，我们推测FABP3可能是一个与心脏发育相关的促凋亡基因，其在室间隔缺损患者心室肌组织中的差异高表达，极有可能通过诱导心肌细胞过度凋亡的机制，影响胚胎心脏形态学的发生。本文为进一步分析FABP3的功能，应用RNA干扰技术沉默FABP3的表达，以P19细胞株为工具细胞开展体外研究，评价FABP3表达沉默对心肌细胞分化、细胞凋亡及线粒体功能的影响，分析FABP3基因与线粒体功能之间的关系及对心肌细胞凋亡的影响，论证FABP3在胚胎心脏发育中的作用及致畸的可能机制，分析其在心脏发生中的作用将可能有助于阐明先天性心脏病的病理生理机制。第一部分FABP3基因表达沉默对P19细胞增殖分化及凋亡的影响目的：通过构建FABP3基因shRNA的慢病毒载体，包装慢病毒干扰P19细胞中FABP3的表达，分析其对P19细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法：设计FABP3干扰靶序列，构建慢病毒重组载体pGLV–U6–Puro-FABP3质粒；将pGLV–U6–Puro-FABP3转染HEK-293T细胞获得病毒上清，并感染P19细胞，应用定量PCR检测干扰效果，CCK-8法检测细胞增殖，应用流式细胞仪检测FABP3沉默对细胞周期的影响，磷脂酰外翻法分析其对凋亡的影响，实时定量PCR检测其对细胞分化的影响。结果：成功构建了慢病毒重组质粒；病毒感染细胞后可抑制P19细胞中FABP3的表达，FABP3mRNA的抑制效率可达到76%；FABP3基因表达沉默抑制细胞增殖，细胞受阻于S/G2期，促进细胞凋亡，但对P19细胞向心肌细胞分化无明显影响。结论： FABP3基因沉默具有抑制P19细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。第二部分FABP3基因表达沉默对心肌细胞线粒体功能的影响目的：探讨FABP3基因表达沉默对心肌细胞线粒体功能的影响。方法：体外培养稳定转染FABP3表达沉默病毒，经1%DMSO诱导分化为心肌细胞，采用电子显微镜观察线粒体形态改变，荧光定量PCR技术检测线粒体DNA的拷贝数；生物发光法检测细胞ATP含量；应用DCFDA（2,7-Dichlorofluorescein diacetate，DCFDA）荧光探针、激光共聚焦检测细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的变化；应用Mitotracker Red荧光探针、激光共聚焦检测线粒体膜电位。结果：1）FABP3基因沉默的心肌细胞中线粒体发生皱缩，嵴减少，部分线粒体肿胀，甚至呈空泡状；2）FABP3基因沉默对心肌细胞中线粒体DNA的拷贝数无显著影响；3）FABP3基因沉默抑制心肌细胞中ATP的合成水平；4）FABP3基因沉默的心肌细胞中ROS的水平明显增高，但线粒体膜电位呈上升趋势。结论： FABP3基因沉默的心肌细胞线粒体出现一定程度的功能受损，该结果提示FABP3基因在维持线粒体正常功能方面可能发挥作用。