状态ATBF1是一个能够调节多种基因的转录调节因子，这些基因具有能够参与组织修复以及保护细胞免于氧化导致的损伤的作用。因此，ATBF1的降低会提高人体对很多疾病的易感性，包括神经退行性病变以及恶性肿瘤等疾病。ATBF1蛋白的不稳定性被发现是一种很重要的疾病发病因素。因为ATBF1是一个404分子量的大的转录调节蛋白，因此，它很容易成为很多的蛋白酶的作用底物。我们发现钙蛋白酶对于ATBF1的降解有着至关重要的作用。同时，我们又发现，成年小鼠脑组织中的ATBF1与胎鼠脑组织中的ATBF1对于钙蛋白酶所引起的降解作用的敏感性有着明显的区别。对照试验显示，胎鼠脑组织中的ATBF1有8个磷酸化位点Ser1600, Ser2634, Ser2795, Ser2804, Ser2900, Ser3431, Ser3613, Ser3697)。而在成年小鼠脑组织中的ATBF1只有一个磷酸化位点(Ser2634)。因为这些位点的磷酸化状态使得胎鼠脑组织中的ATBF1对于钙蛋白酶的降解作用呈现抵制，但是，用牛小肠碱性磷酸酶对ATBF1进行去磷酸化处理，能够提高ATBF1对于钙蛋白酶降解的敏感性。而神经钙蛋白抑制剂—-FK506，同时也是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的抑制剂，能够提高ATBF1对于钙蛋白酶降解的抵抗作用。总之，这些数据表明ATBF1的磷酸化状态是保护ATBF1免于钙蛋白酶降解的重要因素。　　 材料与方法：　　 1、动物:　　 怀孕14天的ICR小鼠以及其胎鼠用来提取成年小鼠脑蛋白和胎鼠脑蛋白。所有的实验都是依据国家老年研究中心动物实验委员会所起草的动物实验准则。成年小鼠和胎鼠的脑被快速的在冰上从头骨中取出，然后用预冷的PBS缓冲液[137mM NaCl，2.7 mM KCl，4.3 mM Na2PHO4，1.4 mM KH2PO4]进行冲洗。冲洗后，用迷你无线研磨机(Funakoshi公司)在预冷的含有20μM糜蛋白酶抑制素的TNE缓冲液中[20 mM Tris-HCl(pH7.4)，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1％乙基苯基聚乙二醇(Sigma公司)，50 mM NaF]进行匀浆处理。匀浆后的组织液在冰上孵育30分钟后用15，000×rpm的转速在4℃下，离心30分钟，取上清进行进一步的分析。　　 2、细胞培养以及转染:　　 人胚肾细胞株HEK293细胞系用含有10％胎牛血清(Invitrogen公司)的D-MEM培养基在5％ CO2，37℃条件下进行培养。HEK293T细胞用HA-标记的表达质粒以及HA-标记的ATBF1表达质粒(HA-ATBF1)用转IT-293试剂(Mirus公司)依照操作技术说明书进行转染[4]。　　 3、Western blot:　　 我们运用Bradford分析试剂(Bio-Rad公司)来测量蛋白的浓度。为了检测蛋白，每一个蛋白样品都用4-20％的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad公司)进行分离后，转印到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）(Millipore公司)上。转印后的膜用含有5％的牛血清白蛋白(BSA)(Fraction V公司)以及0.05％ Tween20的Tris-盐缓冲液进行封闭一小时，然后用一抗在室温下孵育一小时。所有的抗体都用含有1％ BSA以及0.05％ Tween20的Tris-盐缓冲液进行稀释。一抗:兔多克隆抗ATBF1抗体D1-120(1∶1000)以及AT-6(1∶2000)(MBL公司)以及鼠单克隆抗-a-tubulin抗体(1∶8000)（MBL公司）用来标记ATBF1以及蛋白内参a-tubulin。膜与一抗孵育后与二抗在室温下进行孵育一小时。二抗我们使用山羊anti-鼠IgG-HRP抗体(1∶4000)以及山羊anti-兔IgG-HRP抗体(1∶2000)（MBL公司）。二抗孵育后，用ECL Plus试剂(GE Healthcare公司)进行孵育，后用LAS-3000图像处理分析机(Fuji PhotoFilm公司)进行分析。　　 4、[32p]正磷酸盐标记实验:　　 收集大约1.0×107个转染了ATBF1表达质粒的HEK293细胞，用5 ml含有10％的血清的不含任何磷酸盐的D-MEM培养基(Gibco公司)进行洗两次，然后用0.5 mCi[32p]正磷酸盐（GE Healthcare公司）在37℃下孵育两小时后，细胞用PBS洗两次后，用预冷的含有多种蛋白酶抑制剂(Roche公司)的TNE缓冲液进行裂解后，用14，000×rpm的转速在4℃下，离心5分钟后，取上清待进一步的分析。1 mg的蛋白样品与结合了5μg抗ATBF1抗体AT-6(MBL公司)的G-Sepharosebeads(GE Healthcare公司)在4℃孵育16个小时。免疫共沉淀的产物与SDS-PAGE样品缓冲液一起煮沸处理后，用4-20％的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离。一半的产物样品转印到PVDF膜上后用抗ATBF1抗体AT-6进行检测。另外的一半产物样品用4-20％的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离后进行放射自显影。　　 5、蛋白酶抑制剂处理:　　 成年小鼠脑组织用预冷的裂解液20 mM，Tris-HCl(pH7.4)，150 mM NaCl，1％nonident-P40(Sigma)，50 mM NaF]进行裂解。裂解后的20μg的小鼠脑蛋白在10μl的反应体系中，用多种蛋白酶抑制剂(Roche公司)在37℃条件下处理30分钟以筛选出能够导致ATBF1降解的蛋白酶。蛋白酶抑制剂有5μg/ml E-64，10μg/ml亮肽酶素，10μg/ml苯丁抑制素，10μg/ml胃蛋白酶抑制剂，5 mg/ml膦酰二肽，5mg/ml Pefabloc SC以及0.6 mg/ml EDTA。反应体系与SDS-PAGE样品缓冲液一起煮沸5分钟后，降解的反应产物用Western blot进行分析以检测ATBF1的蛋白表达水平。　　 6、钙蛋白酶处理:　　 60嵋的小鼠脑裂解液在30μl的钙蛋白酶反应缓冲液[63 mM imidazol-HCl，pH7.3，10mM，β-mercaptoethanol，5 mM CaCl2]中与终浓度为0.256μg/μl的μ-钙蛋白酶（Calbiochem Darmstadt公司）进行混匀后，在20℃的条件下，按照实验要求不同进行不同时间的孵育。　　 7、统计学分析:　　 至少三次不同的Western blot的实验结果用a-tubulin的表达程度进行校正之后，用平均值±标准误进行描述，并用Students t-test进行统计学分析，*代表p＜0.05，**代表p＜0.005，***代表p＜0.001，n.s.代表没有统计学意义。　　 结果：　　 1、Calpain是可能导致ATBF1降解的蛋白酶之一。蛋白酶抑制剂中，E-64，亮肽酶素，以及EDTA能够显著的抑制ATBF1的降解。可以推断，E-64，亮肽酶素，以及EDTA的共同目标蛋白酶——钙蛋白酶是可能导致ATBF1降解的蛋白酶。　　 2、胎鼠脑组织中的ATBF1能够抵抗calpain对其的降解作用。等量的成年小鼠脑组织蛋白以及胎鼠脑组织蛋白用等量的钙蛋白酶在同样的条件下进行处理。结果发现，成年小鼠脑组织中的ATBF1对于钙蛋白酶的降解作用很敏感，而胎鼠脑组织中的ATBF1对于钙蛋白酶的降解作用具有抵制的效应。　　 3、胎鼠脑组织中的ATBF1处于超磷酸化的状态，只有全长的ATBF1能够被[32p]正磷酸盐所标记。相反的，小的ATBF1的片段不能够被[32P]正磷酸盐所标记。这些数据表明，ATBF1的磷酸化状态可能是阻止ATBF1被降解的一个关键性因素。　　 4、去磷酸化会提高ATBF1对Calpain的敏感性。鼠脑组织蛋白裂解液在被钙蛋白酶处理之前用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)预处理后，我们发现不仅成人小鼠脑组织中的ATBF1对钙蛋白酶的敏感性得到了提高，胎鼠脑组织中ATBF1对钙蛋白酶的敏感性也得到了提高。　　 结论：　　 1、Calpain可能导致ATBF1降解。　　 2、去磷酸化会提高ATBF1对Calpain的敏感性。