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研究目的与意义1.为了解不同宿主来源香港海鸥菌（Laribacter hongkongensis,LH）中的CRISPR/Cas系统分布、结构和进化特征,检测LH中CRISPR位点和cas基因,分析重复序列和间隔序列等结构特点。2.对LH进行耐药分析及相关耐药基因检测,以探讨LH耐药性特征及耐药基因的携带情况。3.分析LH CRISPR/Cas系统与耐药的关系,为探讨该菌CRISPR/Cas系统对耐药的调控机制提供依据。研究方法1.研究菌株共有118株LH,包括本实验室保存的90株活菌,22株LH的DNA,4株本实验室全基因组测序获得的序列,2株NCBI数据库序列。2.利用CRISPRfinder检测NCBI数据库保存的和本实验全基因测序获得的6株LH序列的CRISPR/Cas系统,PCR扩增其他112株菌的CRISPR/Cas系统,测序后检测。3.利用ClustalX 2.1分析重复序列,使用CRISPRTarget and BLASTN对间隔序列进行分析。4.纸片扩散法测定90株LH活菌的13种抗生素的耐药性表型。5.PCR检测90株LH的9种可转移耐药基因,统计基因的检出率。6.应用SPSS 20.0统计软件分析CRISPR与耐药之间的关系,两样本均数的差异性比较采用独立样本T检验,三样本及以上均数的差异性比较采用方差分析,率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率检验,均进行双侧检验,检验水准 α=0.05。研究结果1.118株LH CRISPR的分布:研究中共发现了两个CRISPR位点,即CRISPR4.1 和 CRISPR4.2,其阳性率分别为 91.53%（108/118）、72.03%（85/118）,其中 CRISPR4.1 阵列的上游紧连着 cas基因簇:cas1-cas3-csy1-csy2-csy3-csy4,属于 Ypest subtype I-F 亚型;CRISPR4.2 为孤立位点（orphan locus）。2.CRISPR spacer 特征:118 株 LH 中共检出 2562 个 spacers,其中 980 个是特殊序列（unique spacers）,其中 CRISPR4.1 共 1613 个 spacers,579 个 unique spacers,CRISPR4.2 共 949 个 spacers,401 个 unique spacers。18 个匹配到前间隔序列,主要位于噬菌体（34个）和质粒（19个）上。进一步对三种宿主来源的菌株进行比较发现:（ⅰ）在CRISPR4.1、CRISPR4.2中,人源株和蛙源株的的平均spacer数目多于鱼源株（p均<0.05）;人源株中unique spacers 占比最大（97.46%、98.63%）,其次是蛙源株（56.63%、70.86%）（p均<0.05）;人源株和蛙源株的的等位基因数目分布多于鱼源株（p均<0.05）;（ⅱ）CRISPR4.1 spacers 多于 CRISPR4.2（p<0.05）。3.耐药表型与耐药基因的检测:90株LH对利福平、头孢噻吩、氨苄西林、复方新诺明、红霉素、四环素、链霉素、环丙沙星、氨曲南、头孢吡肟、氯霉素、阿米卡星、亚胺培南的耐药率分别是82.2%、68.9%、45.6%、26.7%、21.1%、16.7%、14.4%、8.9%、7.8%、7.8%、6.7%、2.2%、1.1%。鱼源株对氨苄西林、头孢噻吩、红霉素、利福平的耐药率高于蛙源株（p均<0.05）,而对四环素、环丙沙星、复方新诺明和链霉素的耐药率则低于蛙源株（p均<0.05）。6种耐药基因sul1、sul2、tetA、tetB、ereA、aac（6）-ib的检出率依次为20.0%、7.8%、35.6%、26.7%、5.9%、4.5%,蛙源株的携带率均高于鱼源株（p均<0.05）。tetM、ermB、qnrA三种耐药基因未检出。4.CRISPR位点和CRISPR spacer与耐药性的关系:CRISPR4.1与13种抗生素无明显关联,CRISPR4.1 spacer数目与头孢噻吩耐药性存在负相关关系;CRISPR4.2阳性株的多重耐药、头孢噻吩、氨苄西林、链霉素耐药率（分别为45.16%、61.29%、37.10%、8.06%）低于 CRISPR4.2 阴性株的耐药率（分别为78.57%、85.71%、64.29%、28.57%）（p均<0.05）,CRISPR4.2 spacer 数目主要与多重耐药、头孢噻吩相关,耐相应抗生素菌株的CRISPR平均spacer数目少于非耐药菌株（p均<0.05）。不同宿主来源菌株中:鱼源株中,CRISPR4.1及spacer数目主要与13种抗生素无明显关联,CRISPR4.2及spacer数目主要与氨苄西林存在负相关关系,CRISPR 阳性株中相应的抗生素耐药率低于CRISPR阴性株的耐药率（p均<0.05）;耐相应抗生素菌株的平均spacer的数目少于不耐药菌株（p均<0.05）。蛙源株中,CRISPR4.1及spacer数目与多重耐药分布和13种单抗生素耐药性的分布差异均无统计学意义（p均>0.05）;CRISPR4.2主要与多重耐药存在负相关关系（p<0.05）。5.CRISPR和CRISPR spacer数量与耐药基因的关系:CRISPR4.2阳性株的sul1携带率高（p为0.012）,sul1阳性蛙源株中CRISPR spacer数目多于sul1阴性株。研究结论1.CRISPR结构广泛存在于LH中,且CRISPR4.1位点与cas基因簇组成CRISPR4.1/Cas系统,CRISPR4.2位点为孤立位点。2.CRISPR4.1、CRISPR4.2的spacer数目均较多,人源株和蛙源株的基因多态性水平明显高于鱼源株,相比而言,蛙源株更接近于人源株。CRISPR4.1比CRISPR4.2更为活跃。3.广东省淡水产品中LH对抗生素的耐药性较为严重,鱼源株和蛙源株具有不同的耐药模式。sul1、sul2、tetA、tetB、ereA、aac（6’）-ib耐药基因的检出,可从一定程度上解释LH耐相应抗生素的耐药机制。4.CRISPR4.1与多重耐药分布没有明显关系,CRISPR4.1间隔序列数量与头孢噻吩分布存在关系。CRISPR4.2与多重耐药、头孢噻吩、氨苄西林、链霉素存在负相关关系;CRISPR4.2间隔序列数量与多重耐药、头孢噻吩存在相关关系,耐相应抗生素菌株的CRISPR平均spacer数目少于非耐药菌株。CRISPR4.2阳性株中sul1携带率高。5.CRISPR和CRISPR spacer数目与耐药关系分析中,鱼源株与蛙源株分析结果并不一致,存在关系的主要表现在蛙源株中。