橘小实蝇Bactrocera dorsaliss(Hendel)是一种危害广泛的果蔬害虫,每年在我国乃至全球都造成了较大的经济损失。磷脂酶A2(PLA2)作为一类可以在sn-2位水解细胞膜磷脂的酶,其水解产物包含多种游离脂肪酸和溶血磷脂。PLA2酶可参与脂类消化代谢、细胞膜重塑、细胞内信号转导等多个生理过程。近年来PLA2也被报道在免疫和生殖两大系统发挥重要作用,然而在昆虫中,PLA2是否参与到体液免疫和生殖中目前还没有相关文献报道。本研究主要采用RNAi的方法沉默橘小实蝇体内PLA2基因,分析橘小实蝇体液免疫反应及生殖能力的变化,阐述PLA2的作用机制,以期为橘小实蝇的科学综合防治提供新的思路和新的作用标靶。1.橘小实蝇PLA2基因表达模式根据实验室已有的橘小实蝇转录组文库,我们获得了在橘小实蝇成虫阶段高表达的PLA2基因全长,编码区与其它昆虫PLA2的序列同源性均较高。不同龄期的相对表达量分析结果表明:PLA2在橘小实蝇卵期和成虫期表达显著高于其他龄期。成虫不同组织中的表达量结果则显示:PLA2在成虫脂肪体和精巢中的表达量高于其他组织。2.PLA2调节橘小实蝇体液免疫反应三种不同的病原菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)刺激橘小实蝇后,结果显示,病原菌刺激均可以增高橘小实蝇体内PLA2的表达量,且均在脂肪体中增高幅度最大。沉默PLA2基因显著降低体液免疫通路基因的表达量,包括Toll通路中的My D88和defensin以及Imd通路中的relish和diptericin基因的表达量均出现了显著的下调。橘小实蝇干扰处理后再进行病原菌刺激,结果显示;注射L.monocytogenes和S.aureus后,ds-egfp组My D88和defensin表达量显著高于CK组,而ds-PLA2组中My D88表达量比ds-egfp组中分别减少了47%和57%,defensin表达量相对于ds-egfp组则下调了66%和58%。感染L.monocytogenes和E.coli后24小时,我们检测了Imd通路中relish和diptericin基因表达水平,在ds-egfp组中两个检测基因的表达水平都显著高于CK组。而相较于ds-egfp组,ds-PLA2组中relish和diptericin基因的表达水平均出现了下调。注射L.monocytogenes后,ds-PLA2组中relish和diptericin比ds-egfp组分别发生了60%和44%的下调。而注射E.coli后,ds-PLA2组中relish和diptericin比ds-egfp组分别发生了71%和54%的下调。同时,我们发现注射L.monocytogenes后,ds-PLA2组橘小实蝇MTD减少,死亡率增多。这些结果表明,PLA2基因参与调节橘小实蝇体液免疫反应。为进一步探究PLA2在橘小实蝇体液免疫反应中作用机制,我们用尼罗红染色法观察检测了橘小实蝇脂肪体细胞的形态。PLA2基因沉默后,脂肪体细胞中油脂滴显著减少,脂肪体细胞形态发生显著变化。这表明,PLA2可能通过影响脂肪体细胞中脂类的含量来调节昆虫体液免疫反应。3.PLA2影响橘小实蝇雄虫生殖能力我们检测了橘小实蝇雄虫羽化后体内PLA2的表达谱,结果显示,PLA2表达量在雄虫性成熟前有一个急速增高期。同时,我们采用了两次注射法RNAi成功地在橘小实蝇雄虫交配前始终抑制PLA2的表达量。处理过的雄虫与正常处女雌虫交配后,其子代卵的孵化率、单雌子代幼虫数、卵到蛹的存活率显著降低。为探究其作用机理,我们对雄虫精子进行了荧光染色,测定精子活力。结果显示,PLA2沉默后雄虫体内精子总数没有显著变化,但精子存活率显著降低。对照组中活精子占总精子数的70.1%,而沉默PLA2后活精子仅占41.5%,下降了40.8%。这表明PLA2可通过调节橘小实蝇雄虫精子的存活率来影响雄虫的生殖能力。以上结果表明,PLA2可调节橘小实蝇脂肪体细胞内脂类含量和雄虫精子的存活率,从而调节体液免疫和雄虫的生殖能力,在橘小实蝇免疫和生殖中发挥重要作用。