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2,3,5-三甲基氢醌（TMHQ）是人工合成维生素E的重要前体,维生素E作为目前市场容量最大的维生素产品之一,在医药、饲料、化妆品等方面有着广泛的应用。2,3,6-三甲基苯酚（TMP）氧化还原法和异佛尔酮法是工业合成2,3,5-三甲基氢醌的主要方法,但是化学法普遍存在反应步骤多,反应条件苛刻,催化剂及溶剂的使用对环境造成污染等问题,而生物催化法具有反应条件温和、绿色清洁等优点。为此,本课题通过构建氧化还原酶库,从中筛选出能够一步催化TMP生成TMHQ的生物催化剂,并在此基础上通过优化反应条件和定向进化的方法提高其催化活性。通过检索美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行基因挖掘,克隆了来源于不同物种的氧化还原酶并构建E.coliBL21（DE3）重组菌进行诱导表达,通过调整诱导温度、诱导时间和分子伴侣等进行表达优化,最终获得6个可溶性表达的蛋白,成功构建了氧化还原酶库;在此基础上,以2,3,6-三甲基苯酚（TMP）为底物,NADH为氢供体,筛选能够合成2,3,5-三甲基氢醌（TMHQ）的目标蛋白,最终获得4个具有目标催化活性的重组酶,即来自于大肠杆菌的HapC和UbiH-K、来自枯草芽孢杆菌的yjiB和来自巨大芽孢杆菌的P450BM3,其中以P450BM3的催化活性最佳。在确认P450BM3对2,3,6-三甲基苯酚的催化活性后,从辅酶特异性、温度、pH、底物浓度、助溶剂及助溶剂浓度和金属离子等七个方面对反应体系进行了优化。结果表明,底物浓度为0.5mM时,P450BM3能利用NADH和NADPH两种辅酶进行催化反应,反应最佳温度为25℃,最适pH为7.0,最适助溶剂为丙酮,助溶剂溶度为5%,金属离子Fe2+能促进反应进行;经过一系列反应条件的优化,P450BM3催化TMP生成TMHQ的产物得率由最初的0.4%提高到3.19%,提高了近7倍。为了进一步提高P450BM3 一步催化TMP生成TMHQ的催化活性,采用定向进化的手段对酶进行改造。结合P450BM3晶体结构和文献报道催化非天然底物的分子改造经验,运用定点饱和突变的方法构建突变体文库,利用咪唑蓝/吩嗪硫酸甲酯（MTT/PMS）显色的高通量筛选方法,获得活性分别提高57.5%和71.9%的两株突变体I259P和L181Q。动力学参数分析表明,两个突变体的Km值相比野生型均有所下降,对底物更具亲和力,总催化活性（kcat/Km）也均高于野生型。分子对接结果表明,L181Q的突变有利于关键氨基酸间氢键的形成从而稳定催化中心,促进反应进行,I259P位点突变则改变了底物通道内氨基酸残基与底物的相互作用,使底物分子更接近催化中心Fe原子。研究结果表明,生物催化剂代替化学法合成药物中间体具有一定的可行性,本研究中成功筛选到能够一步催化TMP合成TMHQ的生物催化剂,为生物合成TMHQ奠定了基础。