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光动力学疗法(photodynamic therapy, PDT)已经成为一种有效的治疗癌症的方法,但常规光敏剂副反应重和需要较长时间避光等缺点又限制了其进一步临床应用。δ氨基酮戊酸(aminolaevulinic acid, ALA)诱导肿瘤细胞产生原卟啉Ⅸ来进行光动力学治疗因代谢快、毒副作用小等优点,是一种很有前途的治疗癌症的方法。我们已完成的ALA在结肠癌动物模型中的作用表明,ALA诱导的PPIX在肿瘤内浓度明显高于周围正常组织,PDT后可明显杀伤癌细胞。但其作用还不够强,增加该PDT疗效是重要的研究方向之一。本研究试图将光动力学疗法与CD自杀基因转染结合达到增强杀伤结肠癌作用的目的,同时探讨光动力学对结肠癌细胞周期关卡基因Chk1、Cyclin E、Cdk2的影响,为结肠癌光动力学治疗和作用机理提供依据。方 法本研究在SW480结肠癌细胞培养的基础上,将胞嘧啶脱氨酶(CD)基因转染癌细胞后,再用PDT治疗,探讨其增效作用及对细胞周期关卡基因的影响。本研究分3个部分。1.首先采用大肠杆菌将CD基因质粒进行扩增,用酶切电泳、基因测序等进行鉴定,然后采用脂质体介导的基因转移技术将CD基因转染SW480结肠癌细胞,加用5-Fc后采用高效液相色谱分析技术观察SW480/CD细胞转化产生5-Fu的量,用MTT法检测细胞细胞存活率,研究杀伤作用规律。2. 激光共聚焦显微镜分析ALA诱导SW480结肠癌细胞内产生PPIX的变化规律;MTT和流式细胞分析术用于探讨ALA-PDT结合CD/5Fc自杀基因系统对结肠癌细胞的杀伤作用以及对结肠癌细胞周期的影响及意义。3.采用RT-PCR、Western Blot、、组织细胞原位杂交、免疫组织化学等方法进行研究、探讨PDT、PDT+CD/5Fc自杀基因系统作用后对结肠癌细胞周期关卡基因Chk1、Cdk2、CyclinE 的mRNA和蛋白的影响。结 果1.CD基因 pCMVCD质粒经过扩增后酶切、电泳和基因测序,所得的基因片段为所需的目的基因片段。经过脂质体法将CD基因转染SW480细胞,经过G418筛选,获得转基因成功的SW480-CD细胞。 本课题受国家自然科学基金资助(NO.30271481)<WP=12>2.加入5-Fc后4天后转染CD基因成功的细胞培养液中有明显5-Fu产生,未转CD基因的细胞培养液中则没有检测到5-Fu。加入5-Fc 24小时后,相同时相高浓度组SW480-CD细胞培养液中产生的5-Fu比低浓度组明显增加(P<0.01);加入5-Fc 12小时开始,SW480-CD细胞培养液中5-Fu的浓度随时间延长逐渐增多。3.加入5-FC后,SW480细胞存活率与对照组比较无明显变化(P>0.05);SW480-CD组结肠癌细胞存活率明显降低,其变化规律:在0.001-10mMol/ml范围,随5-FC浓度升高SW480-CD结肠癌细胞的存活率降低;随5-FC加药时间延长,SW480-CD结肠癌细胞的存活率降低。4.加入ALA后SW480细胞产生PPIX的量随时间延长,PPIX量逐渐增加,加药后8小时达最高峰,24小时后又恢复到正常细胞水平。PPIX荧光主要产生在细胞浆内,细胞核内较少。SW480细胞和SW480-CD细胞内荧光强度没有显著差异。5.PDT结合5-Fc作用SW480-CD结肠癌细胞24小时后,与PDT组和单独5-Fc组比,细胞存活率明显降低(P<0.01)。PDT结合5-Fc组杀伤作用曲线明显左移。6.PDT 作用24小时后,SW480细胞G1细胞比率明显降低(P<0.01),S期细胞比率则从12小时开始明显升高(P<0.01)。PDT结合5-Fc对SW480-CD结肠癌细胞作用后与作用前比较,各期细胞比率无明显变化(P>0.05),但凋亡细胞比率明显增加(P<0.01)。7.PDT作用后6小时可以引起Chk1 mRNA和蛋白表达增强,12-24小时达到最高,CD/5-Fc组更明显,且在细胞核和细胞浆内均有表达。8.PDT作用后12小时后可以引起Cyclin E、Cdk2的mRNA和蛋白表达降低,呈时间依赖性变化。Cdk2蛋白在细胞浆和胞核均有表达,而Cyclin E蛋白36小时在胞浆内表达较多。结 论1.将CD基因成功地转染SW480结肠癌细胞,经G418筛选,获取了抗性克隆,且能在癌细胞内发挥CD基因作用。2.转染CD基因的SW480细胞可将5-Fc转化为5-Fu,转化量随着时间的延长和浓度的提高而明显增多,未转染CD基因的细胞则不能。5-Fc可明显引起转染CD基因的SW480细胞死亡,其杀伤作用有一定的浓度依赖性,可能存在“饱和”现象;对未转染CD基因的细胞则没有明显影响。3.ALA诱导SW480细胞产生PPIX的量在加药后8小时达最高峰,24小时后又恢复到正常细胞水平,PPIX荧光主要分布在细胞浆内。SW480与SW480-CD细胞代<WP=13>谢产生PPIX的量和变化规律无明显差异。4.PDT结合5-Fc可明显增强杀伤SW480-CD结肠癌细胞作用,主要体现在PDT 24小时以后,杀伤作用曲线明显左移;PDT结合5-Fc对未转染CD基因的结肠癌细胞无增强杀伤作用。5.静止期SW480细胞对PDT比较敏感,细胞内PPIX量较多是原因之一;增殖期细胞相对不敏感。PDT与5-Fc结合对静止期和增殖期癌细胞均有杀伤作用,且可明显诱导细胞凋亡。6.PDT可诱导Chk1 mRNA和蛋白表达增强,CD/5-Fc组更明显。PDT可以引起Cyclin E、Cdk2的mRNA和蛋白表达降低,呈时间依赖性变化,提示该PDT可影响G1/S关卡调控作用,可能为PDT治疗结肠癌开展增效研究提供新的作用靶位。