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研究目的：建立具有主动靶向和缓释作用的蟾毒灵载药纳米粒的制备工艺和质量标准；探讨其药物释放规律、体内外药物靶向分布、对人结肠癌细胞的生长抑制作用和对裸鼠结肠癌的治疗作用，揭示其药理学机制。研究方法：蟾毒灵多级靶向纳米粒制备方法：选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、多聚左旋赖氨酸（PLL）为载体材料与RGD共修饰，采用乳化溶剂蒸发法，建立RGD修饰的蟾毒灵多级靶向纳米粒（Bufalin Nanoparticles，BNP）的制备方法，先后考察了7个因素对纳米粒形成的影响，采用正交实验优化了BNP的制备工艺。对蟾毒灵多级靶向纳米粒的有关理化性质进行研究：扫描电镜照片评价纳米微粒表面结构；光学显微镜观察纳米粒的粒径分布；检测蟾毒灵多级靶向纳米粒的包封率、载药量等，并观察体外药物释放规律。蟾毒灵多级靶向纳米粒靶向分布实验：Rb做荧光探针包裹于纳米粒中，激光共聚焦显微镜下观察摄入到细胞中纳米粒的分布情况；活体成像仪对荷SW620肠癌小鼠进行活体靶向荧光成像，观察载药纳米粒的体内分布情况。蟾毒灵多级靶向纳米粒体外抗肿瘤实验：CCK-8法观察BNP细胞毒性，以及对人肠癌SW620细胞株的生长抑制作用。蟾毒灵多级靶向纳米粒治疗裸鼠肠癌的作用：建立裸鼠移植性肠癌模型并随机分为如下六组分别经尾静脉给药：对照组（生理盐水，NS，13.5ml/kg）；蟾毒灵组（Bufalin，1mg/kg）；mPEG-PLGA-PLL纳米组（mPEG-PLGA-PLL NPs，24.5mg/kg）；mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米组（mPEG-PLGA-PLL-cRGD NPs，24.5mg/kg）；蟾毒灵mPEG-PLGA-PLL纳米组（bufalin-mPEG-PLGA-PLL，含药1mg/kg）；mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米组（bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD，含药1mg/kg）。比较治疗后各组裸鼠的肿瘤生长情况、肿瘤坏死程度和生存时间。结果：蟾毒灵多级靶向纳米粒的制备及有关理化性质：以乳化溶剂蒸发法制备的蟾毒灵多级靶向纳米粒，纳米粒大小均匀，外形圆整，平均粒径为164±84nm，Zeta电位为2.77mv，包封率和载药量分别为81.7±0.89%、3.92±0.16%。制成纳米制剂后与游离的蟾毒灵单体相比释放速度明显减慢，在24小时后，游离的蟾毒灵单体释放已达90%，而蟾毒灵多级靶向纳米粒释放仅为50%，蟾毒灵多级靶向纳米粒在192小时后释放达90%。药物分布研究：用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL纳米粒培养的HUVECs的荧光强度，要明显低于用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒培养的HUVECs的荧光强度。静脉给药后4小时，与Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒的荷瘤裸鼠肿瘤部位的荧光强度要强，但差别不明显。静脉给药后24小时，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒的荷瘤裸鼠肿瘤的荧光强度逐渐增强。而且与Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒的荷瘤裸鼠肿瘤部位显示出较高的荧光强度。体外抗肿瘤实验：CCK-8比色法观察SW620细胞生存率，随着浓度的增加，mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD空白纳米粒的细胞生存率在96%到90%之间，无明显变化，与Bufalin相比，载Bufalin纳米粒的细胞毒性明显增加。从BNP中释放的Bufalin对人肠癌SW260细胞株的生长抑制率均有显著的抑制作用，其作用与剂量和作用时间成正相关。蟾毒灵多级靶向纳米粒治疗裸鼠肠癌的作用：治疗后蟾毒灵多级靶向纳米粒与等剂量蟾毒灵相比，对裸鼠肠癌肿瘤生长抑制更明显，生存期更长。结论：1.本研究采用乳化蒸发法建立了RGD修饰的蟾毒灵多级靶向纳米粒制备方法、质量评价方法。2.与蟾毒灵相比，蟾毒灵多级靶向纳米粒随着时间的延长能够将药物逐步释放出来，在384小时累积释放量为（31.77±2.08）%，具有良好的缓释特征。3. Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒的细胞摄取效率要明显高于Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL纳米粒，活体荧光成像显示Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒能更有效地靶向肿瘤，这表明RGD修饰的蟾毒灵多级靶向纳米粒具有较好的肿瘤靶向作用。4. mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD空白纳米粒的细胞生存率在96%到90%之间，表明载体材料其基本无毒性。与Bufalin相比，载Bufalin纳米粒的细胞毒性明显增加，表明蟾毒灵多级靶向纳米粒能有效提高Bufalin的细胞毒性，这将有助于提高肿瘤治疗的效果。5.蟾毒灵多级靶向纳米粒以纳米剂型给药抗癌效果明显增强，并具有量效依赖性。蟾毒灵多级靶向纳米粒对裸鼠肠癌具有较好的治疗作用，并能明显延长荷瘤裸鼠的生存期。