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克百威(carbofuran,CBF),又名呋喃丹,属于氨基甲酸酯类农药,广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物等害虫的防治。克百威对人、畜禽、鱼、鸟等毒性极高,具有触杀和胃毒作用。近年,基于抗原-抗体结合的酶联免疫快速检测技术开始逐步用于食品中克百威的残留检测。为了深入研究抗原-抗体相互作用机制,进而实现定向提升抗体质量,在前期工作中,本实验室已从分泌抗克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株中,克隆并鉴定出其单链抗体的基因。在此基础上,本论文进一步通过构建可溶性表达载体,实现抗克百威单链抗体及Fv片段的可溶表达,进而分离纯化,为后期深入研究克百威单链抗体结构及其分子识别机制奠定基础,取得的研究结果如下:(1)抗克百威scFv可溶性表达载体构建、表达与分离纯化以实验室前期得到的抗克百威单链抗体CBF-scFv、CBF-evo-scFv基因为模板,经PCR扩增得到CBF-scFv、CBF-evo-scFv基因片段,SacI和XhoI双酶切后,插入到经同样双酶切的pET-22b(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS。利用IPTG分别诱导表达CBF-scFv和CBF-evo-scFv,并对胞内蛋白和培养基上清分别进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和Western blotting分析。结果显示2种单链抗体都能分泌表达。优化的表达条件分别为:对于CBF-scFv,选取LB为培养基,IPTG诱导浓度0.1mmol/L,表达温度为18℃,诱导表达时间24 h,此时目的蛋白可溶表达量占总目的蛋白的10%;对于CBF-evo-scFv,选取LB为培养基,IPTG诱导浓度1 mmol/L,表达温度为18℃,诱导表达时间为16 h,此时目的蛋白表达量可达总目的蛋白的50%。采用Ni Sepharose HP和IexCap SP HP对表达CBF-scFv、CBF-evo-scFv得到的破壁上清液进行纯化,纯化后纯度分别为30%、90%。对CBF-scFv和CBF-evo-scFv抗体片段进行icELISA检测,IC50值分别为108.4 ng/mL和63.80 ng/mL,说明其具备抗原结合活性。(2)抗克百威Fv片段可溶性表达载体构建、表达与分离纯化以CBF-scFv、CBF-evo-scFv基因为模板,分别PCR得到CBF-VH、CBF-VL、CBF-evo-VH、CBF-evo-VL片段,Sac I和XhoI双酶切后,插入到经同样双酶切的pET-22b(+)质粒中,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS中。利用IPTG分别诱导表达抗体片段CBF-VH、CBF-VL、CBF-evo-VH、CBF-evo-VL,并进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和Western blotting分析。结果显示4种抗体片段都能分泌表达,且BL21(DE3)plysS工程菌表达量优于BL21(DE3)工程菌。优化表达条件为,以SB为培养基、培养温度18℃,表达时间为20 h,此时目的蛋白主要分泌到胞内,而当延长表达时间至24h时,目的蛋白主要分泌到胞外。采用Ni Sepharose纯化CBF-VH、CBF-VL、CBF-evo-VH、CBF-evo-VL的表达上清,分别可以得到1.5、2、0.5、3 mg/L的抗体片段,纯度>95%,可满足后续结晶的要求。(3)抗克百威Fv片段与scFv亲和力测定和对比利用非竞争ELISA法测定亲和力常数。对于野生型的CBF-scFv片段,经表达后显示CBF-VH、CBF-VL和CBF-scFv的亲和力常数值分别为3.73×10~6、4.9×10~5和2.3×10~6 L/mol,C BF-VH、CBF-scFv其数值相近,而C BF-VH的亲和力值是CBF-VL亲和力值的7.6倍,说明CBF-scFv与抗原结合主要依赖其重链可变区。CBF-evo-VH、CBF-evo-VL和CBF-evo-scFv的亲和力常数值分别为3.3×10~6、5.29×10~6、5.1×10~6L/mol。VH突变后亲合力并未增加,但是VL突变后亲和力增加了10.8倍,CBF-evo-scFv的亲和力相比CBF-scFv增加2.22倍,说明当突变后VL的亲和力增加,并高于VH的亲和力时,此时的单链抗体的亲和力依赖于VL而并非VH。