论文部分内容阅读
目的:氟在自然界中广泛存在,适量摄入氟可以保持牙齿和骨骼的硬度,维持各系统正常功能,但长期过量地摄入氟会导致机体表现出氟斑牙和氟骨症等症状,其中软骨组织是主要病理损伤部位之一。生长板软骨细胞经历增殖、分化、肥大等阶段,软骨组织逐步被骨组织所代替,实现骨骼延长。有研究表明,过量氟损害软骨细胞的分化和软骨组织的正常矿化,抑制软骨发育过程。PTHrP、Ihh、Mef2C、Runx2和p38等信号分子在软骨细胞增殖、分化过程中均发挥重要作用,但氟是否通过上述分子调控软骨发育尚需进一步研究。组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4,HDAC4）是一种对组蛋白进行修饰的酶,主要表达在软骨细胞。HDAC4可以从细胞质转移至细胞核中,通过去乙酰化修饰,调节组蛋白和非组蛋白功能,从而调控软骨细胞分化。研究表明HDAC4过表达或缺失均会破坏软骨组织的形态和生理功能,但氟是否通过HDAC4调控软骨细胞发育尚未见报道。因此,本研究通过对C28/I2软骨细胞进行染氟处理,检测软骨细胞增殖、分化标志因子（Col2a1、Sox9 和 Col10a1）以及 Ihh/PTHrP 信号通路相关因子（PTHrP、Ihh、Mef2C、Runx2和p38）的表达,并且检测HDAC4在软骨细胞中的表达及磷酸化水平,探讨氟对C28/I2软骨细胞增殖、分化的影响和Ihh/PTHrP信号通路及下游HDAC4等相关因子在其中的调控作用,进一步阐明氟损伤软骨发育的机制。实验方法:本研究选取C28/I2软骨细胞,用不同浓度NaF处理不同时间,通过CCK-8法选取最佳染氟剂量和时间。采用阿利新蓝染色检测软骨细胞蛋白多糖的表达,并采用实时荧光定量PCR检测软骨细胞中ACAN mRNA的表达;采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测软骨细胞增殖标志因子Col2a1和Sox9以及分化标志因子Coll0a1的mRNA和蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测Ihh/PTHrP信号通路相关因子PTHrP、Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表达水平;采用免疫荧光法检测软骨细胞中HDAC4的表达,并用免疫印迹法检测HDAC4的磷酸化水平;采用免疫印迹法检测p38的磷酸化水平。结果:1、氟对C28/I2软骨细胞活力的影响:经过10-6 mol/L、10-5mol/L和10-4 mol/LNaF处理C28/I2软骨细胞72h后,细胞活力与对照组相比无明显改变,而10-3 mol/L NaF处理72h后细胞活力与对照组相比明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。与对照组相比,用10-3 mol/L NaF处理C28/I2软骨细胞24h,细胞活力无明显改变,但处理48h和72h后C28/I2细胞活力均明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。因此,后续实验采用10-3 mol/LNaF处理C28/I2软骨细胞48h和72h。2、氟对C28/I2软骨细胞蛋白多糖表达的影响:NaF组阿利新蓝染色较对照组浅,定量结果显示C28/I2软骨细胞中蛋白多糖表达减少,差异具有显著性（P<0.05）;NaF组软骨细胞中ACAN mRNA表达较对照组明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。3、氟对C28/I2软骨细胞增殖和分化标志因子表达的影响:NaF组C28/I2软骨细胞增殖标志因子Col2a1 mRNA和蛋白表达均较对照组降低,差异具有显著性（P<0.05）;NaF组Sox9mRNA表达较对照组有下降趋势,但无显著性（P>0.05）,Sox9蛋白表达明显下降,差异具有显著性（P<0.05）;与对照组相比,NaF组软骨细胞分化标志因子Coll0a1 mRNA无明显改变,但蛋白表达水平降低,差异具有显著性（P<0.05）。4、氟对C28/I2软骨细胞Ihh/PTHrP负反馈环及下游信号分子的影响:与对照组相比,NaF组PTHrP mRNA和蛋白表达水平均明显升高,差异具有显著性（P<0.05）,NaF组Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。5、氟对C28/I2软骨细胞HDAC4蛋白表达的影响:免疫荧光结果表明,HDAC4主要表达在C28/I2软骨细胞细胞核中,细胞质中有少量表达。NaF组软骨细胞细胞核中HDAC4荧光强度相较于对照组明显增加;NaF组C28/I2软骨细胞HDAC4磷酸化水平下降,p-HDAC4/HDAC4较对照组明显降低,差异有显著性（P<0.05）。6、氟对C28/I2软骨细胞p38蛋白表达的影响:与对照组相比,NaF组p38蛋白磷酸化水平下降,p-p38/p38明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。结论:1、氟抑制C28/I2软骨细胞增殖和分化,降低蛋白多糖表达。2、氟可能通过促进PTHrP表达,抑制Ihh表达,抑制Ihh/PTHrP负反馈环,降低下游HDAC4磷酸化水平,使核表达增加,进而抑制Mef2C表达并下调Runx2,从而抑制C28/I2软骨细胞分化。3、氟可能通过上调PTHrP表达,抑制p38磷酸化,进一步抑制Mef2C表达。