论文部分内容阅读
第一部分载吲哚菁绿与紫杉醇的多功能靶向纳米粒的制备及性能检测目的1.制备一种靶向叶酸受体的载吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)与紫杉醇(paclitaxel,PTX)的新型多功能可相变型纳米粒(folate receptor-targeted and phasechangeable PLGA nanoparticles loaded with paclitaxel/indocyanine green,FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH NPs),并对其基本理化性质进行检测。2.探讨作为药物运载工具FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒的生物安全性以及体外靶向性能的评估。方法1.采用超声乳化的方法,利用高分子材料FA-PEG-PLGA包载ICG、PFH与PTX,制备FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒;同时检测该纳米粒的粒径大小、表面电位、形态以及ICG和PTX的包封率与载药量;采用高效液相色谱法检测纳米粒PTX体外释放特性;用免疫荧光的方法检测纳米粒表面叶酸的生物活性;用近红外热成像仪监测纳米粒的光热转化效果;用倒置显微镜观察纳米粒光致相变的过程。2.CCK-8法检测FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒的生物安全性;叶酸修饰的FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒与未修饰的PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒与叶酸受体高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞,叶酸受体低表达的A549肺癌细胞以及提前用叶酸封闭的MDA-MB-231乳腺癌细胞共孵育,在荧光显微镜下观察纳米粒吞噬情况。结果1.采用超声乳化法成功制备了FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒。马尔文粒径分析仪测得纳米粒的粒径约308±5.82 nm,表面电荷-22.2±6.4 mV,扫描电镜下观察到纳米粒大小分布均匀,成球形。测得ICG的包封率为(27.15±2.91)%,载药量为(1.09±0.12)%;PTX的包封率为(71.71±7.89)%,载药量为(6.69±0.69)%。通过高效液相色谱分析发现,纳米粒经近红外激光辐照后,PTX在体外的释放速率明显增加。免疫荧光法测得纳米粒表面的叶酸具有良好的生物活性。测得纳米粒具有高效的光热转化效果,并且经近红外激光辐照后纳米粒能迅速地相变为微泡。2.CCK-8法测得FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒具有良好的生物相容性。荧光显微镜下观察发现叶酸受体高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞在受体-配体介导作用下能高效的吞噬叶酸修饰的FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒,而未被叶酸修饰的PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒明显吞噬较少。并且当预先拮抗MDA-MB-231乳腺癌细胞表面的叶酸受体后,其吞噬叶酸修饰的FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒数量也随之减少。在叶酸受体低表达的A549肺癌细胞组中,吞噬FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒的数量也较叶酸受体高表达的MDA-MB-231细胞吞噬明显减少。结论1.成功的制备出载吲哚菁绿与紫杉醇的多功能靶向相变型纳米粒FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH,并检测了其基本性能。2.FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒作为药物递送工具,其具有良好的生物相容性。在受体-配体介导作用下,叶酸修饰的纳米粒能高效地被叶酸受体高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞吞噬摄取。第二部分载吲哚菁绿与紫杉醇的多功能靶向纳米粒体外光声/超声双模态显像以及评估其光热治疗联合化疗的抗MDA-MB-231乳腺癌细胞的效果目的1.探究FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒作为光声/超声双模态造影剂体外显像的能力。2.评估FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒的光热治疗联合化疗的抗MDA-MB-231乳腺癌细胞的效果。方法1.将不同浓度的FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒以及未包载ICG的FA-PEG-PLGA-PTX@PFH纳米粒与PBS分别置于琼脂凝胶模型中,在光声成像仪中观察采集图像并测量相应的光声信号强度;将FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒溶液置于琼脂凝胶模型中,用波长为808nm的近红外激光加以辐照,同时在辐照前以及辐照的整个过程用超声成像仪观察采集图像,并对图像进行数据分析。2.将MDA-MB-231乳腺癌细胞做不同的处理分为7组(i:FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;ii:PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;iii:FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒无激光辐照组;iv:FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;v:PTX组;vi:激光辐照组;vii:对照组)。孵育培养24小时后,用CCK-8方法检测计算各组细胞的相对存活率,综合评估各处理因素抗MDA-MB-231乳腺癌细胞的效果。结果1.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒具有显著的光声成像效果。并随着纳米粒浓度的增加,光声信号也成线性地增强。而PBS以及未包载ICG的FA-PEG-PLGA-PTX@PFH纳米粒组未探及明显的光声信号。凝胶模型中的FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒溶液随着激光的辐照,在超声成像系统的B-mode以及Contrast-enhanced ultrasound(CEUS)模式下超声信号都随之增强,尤其在CEUS模式下更容易观察到增强的效果。2.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组细胞存活率最低(P<0.05)。激光辐照组与对照组间细胞存活率无明显统计学差异(P>0.05)。结论1.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒在体外光声/超声双模态成像中展现了显著的增强显像能力。证实了其可做为光声/超声双模态造影剂的潜能。2.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH叶酸修饰的靶向纳米粒所介导的光热治疗联合化疗具有最好的抗MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的效果。同时也验证了近红外激光的安全性。第三部分载吲哚菁绿与紫杉醇的多功能靶向纳米粒体内光声/超声双模态显像以及评估其对荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠的光热治疗联合化疗的效果目的1.评估FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒体内生物安全性以及体内分布情况;探究其作为光声/超声双模态造影剂体内显像的能力。2.评估FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒对荷MDA-MB-231乳腺癌细胞裸鼠的光热治疗联合化疗的效果。方法1.首先将不同剂量的FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒溶液以及生理盐水(对照)注入小鼠后,7 d以后再检测小鼠肝功能、肾功能、血常规等指标;用小动物活体荧光成像系统探究叶酸修饰的FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH靶向纳米粒与无靶向的PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒在体内的分布情况;将叶酸修饰的靶向纳米粒以及无靶向纳米粒分别经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内,再经光声成像仪以及超声成像仪(辅以近红外激光辐照激发纳米粒相变)对肿瘤区域显像,并对采集的图像进行数据分析。2.将荷MDA-MB-231乳腺癌细胞裸鼠随机分为7组并采取不同的处理(i:FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;ii:PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;iii:FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒无激光辐照组;iv:FA-PEG-PLGA@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组;v:PTX组;vi:激光辐照组;vii:生理盐水组),并综合评估各处理手段对肿瘤生长的影响。结果1.注射FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒的小鼠其肝功能、肾功能以及血常规等指标与对照组相比无明显统计学差异(P>0.05);小动物活体荧光显示叶酸修饰的FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH靶向纳米粒注入1 h后,纳米粒在肿瘤区域积聚达到最大值。而且叶酸修饰的靶向纳米粒较无靶向纳米粒在肿瘤区域积聚得更多,滞留时间更长(P<0.05);叶酸修饰的靶向纳米粒在体内肿瘤区域具有良好的光声成像以及超声成像效果,且更优于无靶向纳米粒。2.各种评价手段显示FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒伴激光辐照组具有最佳的抑制肿瘤生长的治疗效果(P<0.05)。且激光辐照组与生理盐水组间无明显统计学差异(P>0.05)。结论1.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH纳米粒在体内具有良好的生物相容性;靶向纳米粒在肿瘤区域积聚的达峰时间为1 h,且较无靶向纳米粒在肿瘤区域积聚得更多,滞留时间更长;其作为光声/超声双模态造影剂在体内具有良好的肿瘤靶向显像能力。2.FA-PEG-PLGA-PTX@ICG-PFH叶酸修饰的靶向纳米粒所介导的光热治疗联合化疗具有最佳的抑制肿瘤生长的治疗效果。同时也进一步验证了近红外激光的安全性。