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PM2.5是一种环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5μm,其化学成分多样、复杂的混合颗粒物。PM2.5作为空气污染物的重要组成成分,与心血管疾病密切相关。虽然目前研究揭示PM2.5诱导的炎性反应及继发的血管内皮损伤是心血管毒效应的重要机制,但是关注点大多集中在PM2.5导致了炎性效应后果上。对于血管炎症级联反应如何激发,炎性、粘附、血小板活化等血管炎性损伤相关细胞因子的来源及受哪些因素调控,以及炎性因子如何作用于血管内皮引起内皮功能紊乱等有待进一步深入研究。另外,评价PM2.5毒性效应时,仅仅考虑颗粒物本身还不够,还应充分评估其化学成分的毒性效应。鉴于此,本论文拟以大气PM2.5对南京居民心血管疾病的死因关系研究为切入点,通过人群健康效应大数据、固定群组人群重复测量观察、体外培养血管内皮细胞mRNA转录组测序,并在人群调查研究和生物信息学分析研究结果基础上,通过体外细胞实验和整体动物实验,进一步深入探讨PM2.5心血管系统血管内皮炎性作用机制,以寻找调控PM2.5炎性损伤级联反应的关键基因、PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的重要金属组分、评价心血管系统血管内皮炎性损伤的敏感指标及潜在的预防靶标,为PM2.5引起人群心血管疾病的防护提供理论依据。一、PM2.5对心血管疾病死亡影响的时间序列分析目的:了解2013-2017年南京市大气PM2.5日平均浓度及心血管疾病日死亡人数的变化趋势,定量评估南京市大气PM2.5对居民各类心血管疾病死亡的影响。方法:收集2013年1月1日-2017年12月31日南京市每日大气污染物资料(PM2.5、SO2、NO2、O3)、气象资料（平均温度、相对湿度）和心血管疾病死亡人数资料,根据ICD-10编码进行疾病分类。用时间序列分析方法建立广义相加模型,调整了长期时间趋势、气象因素、“星期几效应”后,定量研究2013-2017年南京市PM2.5在夏季、冬季、过渡季对不同性别、年龄人群心血管疾病总死亡,以及缺血性心脏病、高血压、心律失常等疾病死亡的影响,并计算PM2.5浓度增加每10μg/m3时,每日因各类疾病死亡人数的超额危险度。结果:（1）2013-2017年南京市主要大气污染物为PM2.5,且所有大气污染物和心血管疾病的死亡情况均呈季节性变化,除O3浓度夏季高于冬季外,其余均表现为冬季高于夏季。（2）单污染物模型分析结果显示:PM2.5对心血管疾病总死亡的效应有统计学意义。从全年水平看,PM2.5浓度每升高10μg/m3,心血管疾病死亡风险增加0.43%（95%CI:0.080.78%）。PM2.5对心血管疾病死亡风险夏季高于冬季和过渡季,且4565岁组更为敏感。在心血管疾病病种分层中,PM2.5对急性心肌梗死的效应在滞后7天（Lag7）最明显,PM2.5浓度每升高10μg/m3,急性心肌梗死的死亡风险增加1.02%（95%CI:0.401.64%）;PM2.5对动脉粥样硬化、冠脉供血不足、心绞痛等缺血性心脏病,以及高血压的效应均在滞后当天最明显,PM2.5浓度每升高10μg/m3,死亡风险分别增加1.10%（0.591.60%）和1.11%（0.142.09%）。（3）在双污染物及多污染物模型中调整其他污染物后,PM2.5对不同种类心血管疾病的效应较单污染物模型出现不同程度的变化,提示污染物之间可能存在相互作用。结论:PM2.5可以增加南京市居民急性心肌梗死、动脉粥样硬化、冠脉供血不足、心绞痛等缺血性心脏病,以及高血压死亡风险,且以夏季、4565岁组更敏感,但没有观察到PM2.5与心律失常死亡的相关性。二、PM2.5及金属成分对血清金属和心血管内皮炎性损伤相关细胞因子影响的人群重复测量研究目的:从人群水平探讨PM2.5及其金属成分心血管系统血管内皮炎性损伤效应和机制,寻找导致心血管系统血管内皮炎性损伤的主要金属成分,以及外周血中评价该类损伤的敏感指标。方法:利用重大活动保障期间政府采取的大气污染控制措施,带来的大气质量暂时改善,选择一组31人健康中年人群,在南京青奥会举办前、举办期间及举办后进行连续5次纵向、多时点的重复测量研究;跟踪观察在此期间大气PM2.5及金属成分浓度、人群金属血清浓度,以及血清中血管内皮炎性损伤相关细胞因子浓度的变化。运用线性混合效应模型,分析PM2.5金属成分（Al、Cr、Mn、Hg、Sb、Pb、Cd、Ni、As）与相应血清金属间、PM2.5与细胞因子（IL-18、IL-10、IL-1β、TNF-α、CRP、MCP-1、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、sCD40L）间、各血清金属与细胞因子间的相关性,以此探讨PM2.5及金属成分对体内金属负荷的影响,以及心血管系统血管内皮炎性损伤效应和机制。结果:严格的大气污染控制政策,使得大气PM2.5浓度在青奥期间下降33.82%,PM2.5金属成分,除了Be外(75%的PM2.5样品Be浓度低于检测限),Al、Cr、Mn、Hg、Pb、Cd、Ni、Tl、Se、Sb和As浓度在青奥会期间均下降,下降幅度前6位的金属为Hg、Mn、As、Cd、Pb、Se,其下降幅度分别为37.85%、33.13%、30.77%、29.45%、18.89%和16.18%。青奥会后,PM2.5浓度及上述金属成分浓度均回升,上升幅度前6位金属为Cd、Be、Hg、Pb、As、Ni,其上升幅度分别为63.04%、50.00%、30.45%、21.31%、21.20%和15.40%。该组人群血清金属浓度变化趋势总体与此变化趋势一致,大多数表现为青奥会期间浓度下降,赛事结束大气污染控制政策解除后回升,其中2448h PM2.5Ni与血清Ni、07d PM2.5Cd与血清Cd存在正相关。在研究的10种参与炎性、血管粘附、血小板激活等与心血管系统血管内皮炎性效应相关的细胞因子中,血清IL-1β、IL-18、sCD40L、VCAM-1、CRP等亦在青奥中下降,青奥后回升。大气PM2.5与血清IL-1β、IL-18、sCD40L、ICAM-1、VCAM-1和P-selectin浓度存在正相关,正相关效应大多出现在1324h和024h。大气PM2.5与血清IL-10在712h、024h表现为负相关。另外,血清金属浓度与血清细胞因子间存在一定的相关性,血清Sb的效应尤为明显,与MCP-1、TNF-α和IL-18存在正相关;血清As与ICAM-1、血清Al与IL-18、血清Mn与VCAM-1存在正相关。结论:PM2.5可以通过激发全身性炎性级联反应,分泌多种炎性、粘附、血小板活化相关细胞因子,以血管内皮为主要攻击标靶,引起血管内皮功能紊乱,PM2.5金属成分参与了此过程,在本研究中Sb、As、Al和Mn的心血管系统血管内皮炎性损伤效应较为显著。血清白介素类炎性因子IL-1β、IL-18、IL-10,参与血管粘附的ICAM-1、VCAM-1分子和血小板活化标记物sCD40L、P-selectin等细胞因子联合使用,可以作为PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的综合评价指标。三、PM2.5对EA.hy926细胞毒性及mRNA转录组分析目的:弄清PM2.5如何激发血管内皮细胞炎症级联反应、各类炎性因子如何相互作用导致血管内皮细胞损伤、该过程受哪些机制调控及金属离子是否参与其中?以转录组学较完整地了解PM2.5导致血管内皮细胞损伤的潜在复杂机制,为进一步的分子机制探讨提供线索。方法:用mRNA表达谱芯片的方法,对PM2.5处理的EA.hy926细胞进行mRNA转录组测序。染毒剂量由MTT法细胞活性检测、细胞周期试验和细胞凋亡试验来确定。mRNA表达谱芯片结果,通过差异表达mRNA筛选、GO分析、KEGG分析、基因相互作用网络分析等生物信息分析方法,了解基因间的相互作用,以及差异基因富集的主要生物过程和通路。结果:mRNA转录组测序设2个处理组:没有明显细胞死亡、细胞凋亡及细胞周期改变的2.5μg/cm2较低剂量组;细胞存活率接近80%,出现明显细胞凋亡和S期阻滞的10μg/cm2较高剂量组。通过差异表达mRNA筛选发现,与对照组相比,在2.5μg/cm2剂量组中有107个基因表达发生改变,其中75个基因表达上调,32个基因表达下调。在10μg/cm2剂量组中,有440个基因表达发生改变,其中297个基因表达上调,143个基因表达下调。高剂量组差异表达基因数量明显高于低剂量组。由GO分析、KEGG分析等生物信息分析,PM2.5对血管内皮细胞的损伤机制在2.5μg/cm2低剂量组以炎性反应为主,多个炎性相关通路和多种金属离子相关的生物学过程被激活,ROS负担也已开始增加。在10μg/cm2高剂量组,氧化应激和炎症级联反应进一步加重,粘附、血小板激活、血管收缩等效应突出;此外,吞噬、脂质代谢异常、纤维化等亦不能忽视。为了检验测序结果的可靠性,且为下一章机制研究提供线索,选择了与炎性、粘附、氧化应激相关的10个差异表达基因进行RT-qPCR验证,其中8个基因的RT-qPCR结果与mRNA表达谱芯片结果一致,说明测序结果可靠。结论:PM2.5激活了与膜受体介导的氧化应激、炎症反应、粘附效应、内吞作用、代谢异常,以及多种金属离子参与的生物过程和通路。mRNA信号网络分析提示PM2.5对血管内皮细胞的毒性由多个参与氧化应激、炎性和粘附生物过程的基因相互调控和作用。四、NOX1在PM2.5致心血管内皮炎性损伤中的作用目的:进一步验证和探讨NOX1在PM2.5对心血管系统血管内皮炎性损伤中的调控作用。方法:用NOX1抑制剂ML090对PM2.5染毒EA.hy926细胞进行干预,比较ML090干预前后,ROS水平及IL-1β、IL-18、IL-10、ICAM-1、VCAM-1和P-seletin等参与血管内皮细胞炎性损伤的细胞因子水平的变化。用平均粒径1μm的金属铝粉代替PM2.5染毒EA.hy926细胞,通过检测金属Al对EA.hy926细胞NOX1基因表达水平的影响,以此验证PM2.5金属成分是否参与了NOX1介导的氧化应激和血管炎性损伤。最后,对小鼠进行PM2.5动态吸入染毒,从整体动物水平观察血清中前炎性因子浓度的变化,以及心、肺、肾等脏器血管内皮NOX1和ICAM-1的表达。结果:EA.hy926细胞经PM2.5染毒后,在多个血管内皮炎性损伤相关细胞因子（IL-18、IL-10、VCAM-1、ICAM-1和P-seletin）水平尚未明显变化的2.5μg/cm2较低剂量组,NOX1基因表达水平和ROS水平已显著升高。ML090干预使PM2.5诱导的NOX1过表达水平下降了54.38%。同时,ML090干预后ROS水平、IL-1β、IL-18、ICAM-1水平较PM2.5染毒组显著下降,IL-10水平升高。C57BL/6小鼠0.4mg/m3 PM2.5吸入染毒,染毒3d和7d,小鼠血清IL-18和IL-10水平与对照组比均显著升高,染毒14d,肺、心脏和肾NOX1和ICAM-1免疫组化结果显示PM2.5染毒使小鼠肺泡壁血管内皮细胞和肾小球血管内皮细胞的NOX1和ICAM-1蛋白水平明显升高,心肌间质血管内皮细胞ICAM-1蛋白水平明显升高,但是心肌间质血管内皮细胞NOX1蛋白水平与对照组相比,未观察到染色增强。另外,本研究选择了在PM2.5金属成分构成比中较高的金属Al对EA.hy926细胞染毒观察NOX1基因表达水平的变化,研究发现金属Al使NOX1基因的表达水平显著上调。结论:NOX1参与了PM2.5诱导的血管内皮细胞ROS堆积和血管炎性反应,其可能是PM2.5致血管内皮炎性损伤的调控基因,下调NOX1可以降低ROS,减轻PM2.5所致的血管内皮细胞功能紊乱。金属Al对NOX1基因表达上调作用,提示PM2.5金属成分可能参与了NOX1调控ROS生成和血管炎性反应过程。综上,本研究进一步证实了PM2.5诱导的心血管系统血管内皮炎性损伤是其致急性心肌梗死、动脉粥样硬化、冠心病等多种心脏疾病的重要机制,且该过程是氧化应激、炎症反应、粘附等多个基因、多种生物功能和多条通路共同参与和相互作用的结果。PM2.5炎症级联反应激活了多种血管活性物质,其中血清白介素类炎性因子IL-1β、IL-18、IL-10,参与血管粘附的ICAM-1、VCAM-1分子和血小板活化标记物sCD40L、P-selectin等细胞因子联合使用,可以作为PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的综合评价指标。在PM2.5心血管炎性反应激活、级联反应增强过程中,ROS的地位不容忽视,NOX1可以通过ROS影响IL-1β、IL-18、IL-10、ICAM-1等因子的水平,从而调控PM2.5所致的血管内皮损伤。NOX1对血管内皮炎性损伤的调控作用,可以是PM2.5直接作用于血管内皮细胞引起,也可以是PM2.5经呼吸道进入机体,对肺、肾等多脏器ROS及血管炎症因子影响而产生的全身性反应。PM2.5金属成分在致血管内皮炎性损伤过程中扮演重要角色,这些金属可能参与了氧化应激、炎症反应、粘附反应相关的多个生物过程和通路。在PM2.5金属成分致心血管系统血管内皮炎性损伤中,可对Sb、As、Al和Mn的毒性效应给予更多的关注。