新型纳米基因载体和蛋白质检测探针的构建、表征与应用

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:laiyongxuan
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纳米材料具有尺寸小、比表面积高、表面活性强等诸多特性,纳米材料与生物技术相结合,为研究阐明生命活动的机理以及解决生物和医学领域面临的实际问题提供了新的途径和方法。磁性纳米颗粒具有低毒安全、无免疫原性和具有结合和保护DNA能力等特点,使用其作为动物体细胞遗传转化的基因载体,有望克服传统基因载体和介导方法在宿主范围、基因装载容量及转化效率方面的局限性,为通过体细胞核移植技术培育转基因动物新品种开辟新途径。条形码DNA作为一种新型DNA纳米材料,具有易于标记、修饰和加工等特点,使用其对抗体进行荧光标记,可克服传统基于抗体的蛋白质检测由抗体种属来源和抗体间交叉反应造成的局限性,实现蛋白质的多重检测。基于上述两点,本论文分别选用PEI包被的磁性纳米颗粒构建基因载体,对其进行综合表征并研究使用其转化猪体细胞;选用条形码DNA标记抗体构建新型蛋白质检测探针,通过多种蛋白质检测方法检验探针蛋白质检测功能,主要研究结果如下:(1)使用扫描电镜、原子力显微镜及激光粒度分析仪对磁性纳米颗粒NPmag观察测试结果显示,NPmag粒径约为150nm,表面Zeta电位为+29.4mV,粒径分布均匀,为规则的球形颗粒,具有良好的分散性,可以结合、压缩质粒DNA形成纳米颗粒基因复合物;NPmag与DNA结合形成复合物后,粒径变大,约200nm,表面Zeta电位下降,为+23.1mV。通过琼脂糖凝胶电泳分析,证实NPmag能够有效负载DNA并对DNA具有酶切保护作用。MTT实验测试NPmag/DNA复合物对PK-15细胞毒性,结果显示复合物对细胞毒性较小。以上结果证实,NPmag是一种优良的基因载体材料。(2)使用PEI包被的磁性纳米颗粒NPmag作基因载体,以猪肾PK-15细胞为模式细胞,以GFP为外源基因,经细胞转化实验发现,外加磁场能够显著增强NPmag作为基因载体的细胞转化效率;NPmag与DNA质量比1:1条件下构建载体复合物,转化效率最高。通过G418筛选具有新霉素抗性的细胞克隆,获得了稳定遗传表达GFP绿色荧光蛋白的PK-15细胞系,PCR检测结果显示外源GFP基因整合到了细胞基因组中。通过对猪胎儿成纤维细胞(PEF)的转化初探,证实NPmag作基因载体同样能够实现PEF细胞的外源基因转化。这些工作为进一步使用磁性纳米基因载体转化PEF细胞并通过体细胞核移植培育转基因猪新品种提供重要的基础依据。以NPmag作基因输送载体,负载pEGFP-N1和DsRed质粒,对PK-15细胞进行双基因协同转化,转化细胞可同时表达绿色和红色荧光蛋白,为今后利用磁性纳米基因载体实施大片段、多基因协同共转奠定了研究基础。(3)利用不同荧光基团修饰的单链寡核苷酸构建了具有荧光编码功能的条形码Y-DNA。通过Sulfo-SMCC异源接头分子1:1共价合成了DNA-EZZ杂合分子,并以其为中间物,连接条形码DNA和IgG抗体,构建了新型蛋白质纳米检测探针——条形码IgG。抗体竞争性结合试验证实条形码IgG具有与普通IgG抗体相同的抗原结合能力。(4)使用条形码IgG探针,运用斑点杂交、微米粒子检测和免疫组化多种蛋白质检测方法,实现了特异目标蛋白质的单一和多重检测,为使用条形码IgG检测探针在蛋白质检测领域的实际应用提供了理论依据和研究基础。在条形码IgG探针工作的基础上,构建了量子点和HRP酶标探针,并通过Western杂交验证了探针功能,实现了目标蛋白质检测,为使用新型蛋白质检测探针,探索蛋白质检测手段的多样化奠定了研究基础。
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