蛋白酶是一类能够裂解蛋白质或者多肽中肽键的酶,在炎症、心血管疾病、癌症等许多生理生物学过程中都起着不可或缺的作用,因此在临床诊断中被广泛用作疾病的靶标。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）可以降解细胞外基质和基底膜,与肿瘤的发生、发展密切相关,涉及肿瘤的浸润、转移、血管生成。近年来,许多MMPs已成为肿瘤研究的焦点,有望成为肿瘤治疗的重要靶点。因此,发展简便、快速、高灵敏的MMPs活性检测方法对医学诊断、治疗及预后监测等方面具有重要意义。现有的MMPs检测方法中面临两个主要问题:（1）免疫测定法因抗体无法区分活性蛋白酶与其非活性前体而导致的假阳性;（2）基于底物肽的测定法因缺乏信号放大机制而导致的灵敏度不足。因此,对新的传感方法或传感机制的开发显得尤为迫切。合成生物学作为21世纪生物学领域新兴的、重要的生物技术平台,为生物传感器的构建及信号识别元件的开发提供了许多新的工具和方法。近年来,可激活的RNA聚合酶元件受到了科研工作者的广泛关注。它可以实现对细胞内的光、小分子或蛋白等信号分子的响应,将细胞内的各种化学事件转化为可编码的遗传生物学信息。受此启发,我们利用T7溶菌酶（T7 Lysozyme,T7 LYS）对T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase,T7 RNAP）转录活性的调节作用,在体外将RNAP构建成对蛋白酶信号响应的传感元件（Protease-activatable RNAP,PR）。PR将蛋白水解事件转化为核酸信号输出,为蛋白水解酶活性的检测提供了强大的生物识别元件。同时,我们将PR产生的核酸信号与多种传感输出方式相结合,用于构建满足不同条件或需求的蛋白酶生物传感器。其具体的工作内容如下:（1）蛋白水解酶激活响应的PR元件的构建。本节设计和构建了表达PR的重组载体,在原核表达系统中进行蛋白表达和纯化,以及验证PR元件的活性。具体流程如下:我们利用能够被MMP-2特异性识别的底物序列为连接肽将两个蛋白连接,利用同源重组技术获得PRMMP-2的质粒,通过大肠杆菌表达体系诱导PRMMP-2蛋白的表达,并在蛋白纯化系统上通过纯化柱和脱盐柱进行纯化,获得高纯度的PR蛋白。同时在体外通过酶切反应及转录步骤验证了PR元件对靶标的识别特异性和可激活性。此外通过对连接肽的合理设计,我们构建了针对不同蛋白酶（thrombin和NS3/4A）的PR元件,证明PR元件的可拓展性。（2）构建基于PR元件的蛋白水解酶高灵敏荧光分析法（PR-based assay,PRA）。本研究中,我们将转录产生的RNA设计成可被特定的有机荧光染料（Th T）点亮的G-四链体,利用G-四链体与染料结合后产生强烈荧光的特性,将T7 RNAP介导的高效转录特性与G-四链体-RNA染料相互作用的高特异性相结合,构建了PRA。在优化反应条件的基础上,PRA对MMP-2的检测限低至0.07 p M。此外,我们将该方法应用于细胞培养上清液及临床样本中MMP-2活性水平的监测,为临床诊断中蛋白水解酶活性的监测提供了一种高灵敏的通用方法。（3）基于PR与球核酸的MMP-2纸基传感器。在本节中,我们对PR转录RNA的序列进行设计,使其通过碱基互补配对引发球核酸（Spherical Nucleic Acids,SNAs）的组装,产生肉眼可见的颜色变化信号。蛋白水解激活的转录和SNAs的模块化组合有效耦合了其信号转导和信号放大能力,实现了对皮摩尔浓度级别MMP-2的灵敏检测。此外,我们还将SNAs固定到玻璃纤维膜上,发展了一种便携式MMP-2纸基传感器,并利用智能手机作为检测器对比色结果进行记录和定量分析。我们将此方法应用于复杂生物样品中MMP-2活性分析,证明了此种方法的实际应用潜能。（4）基于PR的MMP-2的检测试纸条。在本章中,我们设计和构建了响应PR转录扩增RNA产物的试纸条。RNA产物在检测区域与T线捕获探针和纳米金标记探针互补杂交形成三明治结构而将纳米金固定在T线形成肉眼可见的红色条带,为MMP-2等蛋白酶生物标志物的床旁检测提供了新方法。我们进一步将该试纸条用于荷瘤小鼠血清样本中MMP-2活性水平的检测,得到的结果与标准的底物多肽法结果相一致。此外,该试纸条可对人血清样本中MMP-2活性水平进行检测,有望应用于临床诊断。