目的:肺炎克雷伯菌是临床常见病原菌,可引起患者多重感染和医院获得性感染,其中最严重的是血流感染(bloodstream infections,BSIs)。随着抗菌药的广泛应用尤其是不合理用药,产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)甚至耐碳青霉烯类药物菌株的出现,给临床治疗和院内感染控制带来极大困难,其引起的感染已成为全世界医院获得性感染中导致高死亡率的一个重要原因。尤其近年来出现了高耐药高毒力菌株,虽然尚未广泛传播,但其引起的感染将更难控制。为此,本文拟利用分子微生物学技术分析苏州大学附属第二医院2010-2016年临床分离的血流感染肺炎克雷伯菌。旨在了解我院血流感染肺炎克雷伯菌的耐药特性、机制以及质粒pLVPK携带的毒力基因、毒力表型等分子特征,并结合临床资料分析,探讨菌株历年流行变化趋势,其分子背景与感染发生的危险因素以及影响预后治疗的因素,研究结果将对临床治疗相应感染提供一定的参考价值。方法:一、血流感染肺炎克雷伯菌的的耐药表型及分子特征1、菌种鉴定与药敏分析:所有肺炎克雷伯菌菌株分离自苏州大学附属第二医院2010-2016年血培养阳性的标本;所有菌株均采用Phoenix System-100BD自动化微生物学系统进行菌种鉴定及分析其抗生素的敏感性。2、耐药表型的确证实验:利用纸片表型确证实验检测ESBLs;改良Hodge试验(modified Hodge test,MHT)、改良碳青霉烯灭活实验(modified carbapenem inactivation method,mCIM)检测碳青霉烯酶。3、耐药基因的检测:利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对编码ESBLs的基因(blaCTX、blaTEM、blaSHV)及编码碳青霉烯酶的基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48)进行扩增,阳性扩增产物进一步测序鉴定。4、分子流行特征分析:利用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析菌株同源性;在PFGE的基础上利用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)对肺炎克雷伯菌进行分子分型。二、血流感染高毒力肺炎克雷伯菌的鉴定与分析1、高黏液表型实验:利用拉丝实验检测肺炎克雷伯菌的高黏液表型,拉丝实验阳性者为高黏液肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous hmvKP)。2、毒力基因检测及血清荚膜分型:利用多重PCR技术对分离株的毒力基因和血清荚膜分型进行扩增,扩增阳性产物送测序比对。3、菌株毒力分析:利用大蜡螟体内感染模型实验检测相关菌株的毒力。三、不同特征血流感染肺炎克雷伯菌的临床资料调查分析1、收集上述实验血流感染肺炎克雷伯菌对应的临床资料调查信息。2、相关因素汇总分析:结合菌株特征,汇总病人性别、年龄、是否使用侵入性设备、不同病区、原发疾病等因素,利用SPSS 25.0软件进行相关性分析。结果:一、血流感染肺炎克雷伯菌的的耐药表型及分子特征1、共收集153株血流感染肺炎克雷伯菌,98.7%血流感染肺炎克雷伯菌对氨苄青霉素产生耐药性,其他抗生素的耐药率均低于50%。5.2%的分离株对碳青霉烯类抗生素产生了耐药性。2、产ESBLs的分离株占33.3%,产碳青霉烯酶的分离株占5.2%。3、耐药基因检测结果为:blaTEM、blaCTX、blaSHV 阳性率分别为15.0%、11.1%、30.1%。共表达blaTEM和blasHv的阳性率9.8%、blaCTX和blasHV的阳性率为7.2%。三个基因均为阳性的概率为3.9%。表达碳青霉烯酶的基因blaKPC和blaVIM阳性率分别为3.9%和0.7%。未检测到其它碳青霉烯酶基因。4、MLST显示血流感染肺炎克雷伯菌以ST23(13.1%)居多,其次为ST65(3.3%)、ST11(1.3%),ST107、ST15、ST43、ST186 等非重复 ST 型。PFGE 显示除 ST23外的血流感染肺炎克雷伯菌的同源性低,克隆传播的可能性小。二、高毒力血流感染肺炎克雷伯菌的鉴定与分析1、拉丝实验阳性的分离株为32.0%,初步提示为hmvKP。2、多重PCR检测结果显示hvKP共66株,所有hvKP分离株中rmpA为93.9%,rmpA2为77.3%,iroN为87.9%,iutA为83.3%。hvKP的血清型中K1占19.7%,K2占12.1%,并没有检测到K64和K47。hvKP以ST23居多(30.3%),其次是ST65(7.6%),其余为非重复ST型。2016年发现一株ST11 hvKP携带碳青霉烯酶的耐药基因blaKPC。3、大蜡螟感染模型实验显示共有66株毒力相关基因阳性菌株具有高毒力的特性,三天后hvKP组的总生存率为0%-60%,毒力相关基因阴性菌株总生存率为90%-100%。三、不同特征血流感染肺炎克雷伯菌的临床资料调查分析本研究显示hvKP病人所在病区主要集中在急诊科(n=11)、ICU(n=7)、肿瘤科(n=7)、消化内科(n=7)、血液科(n=6)和内分泌科(n=6)。糖尿病是hvKP的独立危险因素(OR=2.123),hvKP的感染可导致肝脓肿(OR=3.921)的发生和中性粒细胞百分比的升高(OR=1.033)。感染发生在ICU(OR=4.466)、男性病人(OR=2.026)及精神状态的改变(OR=2.371)是30天恶化率的独立危险因素。K1型hvKP导致肝脓肿(P=0.034)。本实验显示,hvKP对头孢他啶/克拉维酸的耐药率大于cKP(P=0.001),而对亚胺培南和美罗培南的耐药水平与cKP没有显著差异(P=0.134,P=0.246)。结论:1、我院血流感染肺炎克雷伯菌主要为非克隆性传播;耐药现象较为普遍,甚至出现了碳青霉烯类抗生素的耐药性。2、血流感染hvKP的流行率较高;2016年出现一株高毒高耐的肺炎克雷伯菌;通过动物模型,本实验提出以毒力基因iutA合并其它任一毒力基因的检出来检测hvKP是具有参考价值的。3、本研究提示血清型K1与肝脓肿有关;hvKP感染的男性患者预后不良可能性较大,需要更好的临床防治措施。