论文部分内容阅读
目的：探讨自噬在IFN-γ促进FasL诱导血管平滑肌细胞凋亡中的作用及其相关分子机制。方法：获取SD大鼠胸主动脉,应用贴壁法分离并培养原代血管平滑肌细胞,分别给予IFN-γ或／和FasL处理,采用细胞计数、FCM检测以及蛋白印迹实验分析法等实验方法,检测不同处理因素对血管平滑肌细胞凋亡的影响。采用免疫荧光和蛋白印迹等检测方法,明确IFN-γ对血管平滑肌细胞自噬的诱导作用,并探讨自噬与IFN-γ联合FasL诱导血管平滑肌细胞凋亡中的作用,采用FCM检测血管平滑肌细胞表面Fas的蛋白水平,并用自噬抑制剂预处理细胞,探讨明确自噬与血管平滑肌细胞膜表面Fas表达的中的作用。用慢病毒介导转染FAP-1 shRNA以敲低FAP-1表达,用蛋白印迹实验分析检测载体用于细胞感染,获得FAP-1低表达血管平滑肌细胞并用于实验。以蛋白印迹实验分析和FCM检测血管平滑肌细胞内和膜表面Fas表达的水平,以明确FAP-1对细胞膜表面Fas表达以及IFN-γ联合FasL诱导调控细胞凋亡的影响。采用蛋白印迹实验分析Jak2/STAT1信号通路介导IFN-γ对细胞自噬调节作用。最后,再以不同抑制剂预处理平滑肌细胞,检测在抑制剂存在的情况下,采用FCM分析IFN-γ对细胞膜表面Fas表达的影响,探讨IFN-γ导血管平滑肌细胞自噬及Fas膜转运的的分子机制。结果：IFN-γ或FasL的单独处理血管平滑肌细胞并不能诱导明显细胞凋亡,然而,两者联合作用可明显引起平滑肌细胞凋亡。IFN-γ处理后可以观察到血管平滑肌细胞内FAP-1的水平降低以及和细胞膜表面的Fas的表达增加,而自噬抑制剂预处理细胞能有效阻断IFN-γ对FAP-1表达及细胞膜表面Fas蛋白水平的调节作用。同样,敲低FAP-1基因表达也能使血管平滑肌细胞膜表面Fas的表达水平显著增加。此外,血管平滑肌细胞经IFN-γ处理,可导致Jak2及STAT1的磷酸化水平增加,但是使用Jak和STAT1的抑制剂后,分别预处理细胞,能有效抑制IFN-y诱导细胞自噬和Fas膜表面转运。结论：IFN-y联合FasL可诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡,而凋亡机制的调控主要是由IFN-y通过活化Jak2/STAT1信号通路,下调血管平滑肌细胞内FAP-1的表达,从而促进细胞内Fas向膜表面转运,增强FasL诱导的细胞凋亡。