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缺血性脑卒中是一类常见的神经系统疾病,是世界上疾病致死致残的主要原因,严重危害了人类的身心健康,阻碍社会经济的发展。目前临床上有效的治疗手段是通过溶解栓塞或通过手术治疗实现缺血区血液复灌,但该方法又会引起“脑缺血再灌注损伤”。脑缺血再灌注损伤的致病因素十分复杂,因此深入探究脑缺血再灌注损伤分子病理过程是寻找缺血性脑卒中的有效治疗策略的基础。自噬是一类在外界刺激下细胞自我保护的手段,但越来越多的研究表明,在脑缺血再灌注损伤中自噬是一把“双刃剑”,参与了脑缺血再灌注损伤中神经元的死亡过程。锌指/环指蛋白酶2（zinc and ring finger2,ZNRF2）在中枢神经系统中高度表达,参与神经元突触的建立和维持突触可塑性,但其在神经系统疾病中的研究较少。本研究通过构建大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注体内模型（cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI）以及氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）体外模型,探究ZNRF2对脑缺血再灌注损伤的作用,并明确其机制是否与调控神经元自噬相关,该研究结果可能为缺血性脑卒中治疗和预后评估提供新的靶标。第一部分ZNRF2在缺血性脑卒中患者血液的表达变化目的:观察非卒中对照组和缺血性脑卒中患者外周血中ZNRF2mRNA的表达变化,探讨ZNRF2与脑卒中是否存在相关性。方法:根据缺血性脑卒中的诊断标准,制定患者纳入/排除标准,收集重庆市垫江县人民医院患有缺血性脑卒中的患者以及非卒中对照组的血液样本,采用q RT-RCR法检测血液中ZNRF2 mRNA的表达水平。结果:总共收集81例临床血液标本,其中缺血性脑卒中患者40例,非卒中对照组41例。1.非卒中对照组与缺血性脑卒中患者之间年龄、性别、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均无统计学差异;而缺血性脑卒中患者中高血压患者数目明显高于正常人群（62.5%vs.26.8%,P<0.01）,缺血性脑卒中患者的HDL水平明显低于正常人群（1.25±0.29 mmol/m L vs.1.46±0.37mmol/m L,P<0.01）。2.与非卒中对照组相比,缺血性脑卒中患者血液中ZNRF2 mRNA显著降低（P<0.05）;缺血性患者血液中ZNRF2 mRNA的表达与NIHSS评分呈负相关（R~2=0.1054,P<0.05）;结论:1.ZNRF2在缺血性脑卒中患者临床血液样本中明显降低2.ZNRF2 mRNA表达与缺血性脑卒中患者NIHSS评分呈负相关3.ZNRF2可能参与了缺血性脑卒中疾病的发生与发展第二部分ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用观察目的:观察ZNRF2在脑缺血再灌注大鼠血浆和再灌注不同时间皮层中的表达改变;给予ZNRF2过表达慢病毒,观察ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及对神经元自噬的影响。方法:1.大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型的构建雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（1m L/kg）麻醉,激光多普勒血流仪检测脑血流动态变化过程;分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）,结扎CCA和ECA,线栓从ICA切口处插入（深度约为2 cm）,脑血流下降70%左右。缺血1.5 h后,进行再灌注,大鼠再灌注时间随实验目的不同而不同。2.实验分组及处理（1）脑缺血再灌注大鼠血液及皮层ZNRF2 mRNA、蛋白表达变化:将大鼠随机分为7组,正常组（normal）、假手术组（sham）、MCAO/R6 h组、MCAO/R 12 h组、MCAO/R 24 h组、MCAO/R 48 h组和MCAO/R72 h组,n=4。（2）为了探究ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用,将实验大鼠随机分为4组:假手术组（sham）、模型组（MCAO/R）、模型组+空载病毒组（MCAO/R+LV-NC）、模型组+ZNRF2过表达慢病毒组（MCAO/R+LV-ZNRF2）,n=10。大鼠缺血1.5 h,再灌注24 h。模型组+空载病毒组、模型组+ZNRF2过表达慢病毒组在造模前14天侧脑室分别给予空载病毒和ZNRF2过表达病毒感染动物。3.观察指标:激光多普勒血流仪检测脑血流动态变化过程;Zea-longa评分法观察各组大鼠的神经行为障碍;TTC染色观察各组大鼠脑梗死体积;HE染色观察各组大鼠皮层组织病理学改变;透射电镜观察皮层神经元中自噬小体;q RT-PCR检测大鼠血浆、损伤侧皮层中ZNRF2mRNA表达;WB检测大鼠损伤侧皮层ZNRF2、m TOR、p-m TOR（ser2448）、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白的表达改变;免疫荧光法观察大鼠皮层神经元LC3、p62蛋白表达改变。结果:1.激光多普勒血流仪检测缺血过程中脑血流下降70%左右;与sham组相比,MCAO/R组大鼠血浆的ZNRF2 mRNA表达明显降低（P<0.001）,大鼠皮层中ZNRF2 mRNA和蛋白在再灌注6-12 h均先上升,再灌注24 h、48 h以及72 h后显著降低（P<0.05）;神经功能缺损评分（P<0.001）和脑梗死体积明显增加（P<0.001）;大鼠皮层细胞核固缩、核深染、空泡现象明显增加（P<0.001）;皮层神经元自噬小体数目增加（P<0.001）;p-m TOR（ser2448）/m TOR（P<0.001）、p62（P<0.01）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显下调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.05）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.01）表达显著上调。2.与LV-NC组相比,给予ZNRF2过表达慢病毒后,大鼠神经功能缺陷评分（P<0.01）和脑梗死体积显著降低（P<0.01）;皮层中细胞的细胞核固缩、核深染、空泡现象明显改善（P<0.001）;皮层神经元的自噬小体数目明显减少（P<0.05）;大鼠皮层ZNRF2（P<0.01）、p-m TOR（ser2448）/m TOR（P<0.001）、p62（P<0.01）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显上调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.05）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.05）表达显著降低。结论:1.ZNRF2 mRNA、蛋白在MCAO/R大鼠血液和皮层均明显降低2.MCAO/R大鼠皮层中自噬过度激活,脑组织受损3.ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用4.ZNRF2保护大鼠脑缺血再灌注损伤与抑制皮层神经元自噬相关第三部分ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤中的作用观察目的:观察ZNRF2在OGD/R处理的PC12细胞中表达改变;观察ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的作用以及对细胞自噬的影响。方法:1.OGD/R模型建立:PC12细胞氧糖剥夺2 h,复糖复氧24 h。2.实验分组及处理（1）OGD/R处理的PC12细胞ZNRF2 mRNA、蛋白表达:将PC12细胞分为正常对照组（normal）、模型组（OGD/R）,n=3。（2）为了探究ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的作用,将细胞分为:正常组（normal）、模型组（OGD/R）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组（OGD/R+LV-ZNRF2）、模型+小干扰RNA阴性对照组（OGD/R+si NC）、模型+ZNRF2小干扰RNA组（OGD/R+si R-ZNRF2）,n=3。3.观察指标:MTT实验观察PC12细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;q RT-PCR检测ZNRF2 mRNA的表达;WB观察PC12细胞中ZNRF2、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、m TOR、p-m TOR（ser2448）蛋白的表达。结果:1.与normal组相比,OGD/R组ZNRF2 mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.01）均显著降低;PC12细胞活力明显降低（P<0.01）;细胞凋亡率增加;p62（P<0.001）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值显著降低（P<0.001）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）蛋白表达明显上调。2.与LV-NC组相比,ZNRF2过表达慢病毒组PC12细胞活性明显增加（P<0.01）;细胞凋亡率降低;ZNRF2（P<0.05）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值明显降低（P<0.01）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）蛋白表达明显降低,p62（P<0.05）蛋白明显上调。3.与si NC组相比,si R-ZNRF2组PC12细胞活力降低（P<0.05）;细胞凋亡率增加;p62蛋白表达明显下调（P<0.001）,Beclin1（P<0.05）、LC3II/LC3I（P<0.01）蛋白表达明显增加。结论:1.OGD/R处理的PC12细胞ZNRF2 mRNA和蛋白表达明显降低2.PC12细胞经OGD/R处理后自噬过度激活,细胞受损3.ZNRF2保护OGD/R致PC12细胞损伤4.ZNRF2保护OGD/R致PC12细胞损伤可能与抑制PC12细胞自噬激活相关第四部分ZNRF2对OGD/R致原代培养皮层神经元损伤的作用观察目的:观察上调ZNRF2对OGD/R致原代培养皮层神经元损伤的影响,并探究其机制是否与m TORC1介导的神经元自噬相关。方法:1.原代培养皮层神经元OGD/R模型建立:皮层神经元原代培养7天,氧糖剥夺30 min,复糖复氧24 h,建立OGD/R致皮层神经元损伤模型。2.实验分组及处理:（1）OGD/R处理的皮层神经元ZNRF2 mRNA和蛋白表达:将皮层神经元分为两组:正常组（control）、模型组（OGD/R）,观察ZNRF2的表达改变,n=3。（2）为了探讨ZNRF2对OGD/R诱导的皮层神经元损伤的作用及机制,将神经元分为:control组、OGD/R组、模型+空载病毒+DMSO组（OGD/R+LV-NC+DMSO）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组（OGD/R+LV-ZNRF2）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组+rapamycin（200n M）组（OGD/R+LV-ZNRF2+rapamycin）,n=3。空载病毒和ZNRF2过表达慢病毒分别于细胞造模前72 h给予。3.观察指标:MTT检测神经元活力;TUNEL染色检测神经元凋亡率;q RT-PCR检测ZNRF2 mRNA的表达;WB检测ZNRF2、m TOR、p-m TOR（ser2448）、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白的表达改变。结果:1.与contral组相比,OGD/R组中ZNRF2 mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）均显著降低;神经元活性明显降低（P<0.001）;神经元凋亡率明显增加（P<0.001）;p62（P<0.01）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值（P<0.01）、Bcl-2蛋白明显降低（P<0.001）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）、Bax（P<0.01）蛋白表达明显增加。2.与LV-NC+DMSO组相比,LV-ZNRF2组神经元活性明显增加（P<0.05）;神经元凋亡率明显降低（P<0.01）;ZNRF2（P<0.001）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值（P<0.05）、p62（P<0.001）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显上调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.01）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.01）表达明显降低。3.与OGD/R+LV-ZNRF2组相比,OGD/R+LV-ZNRF2+rapamycin联合干预组中,神经元活性明显降低（P<0.05）;神经元凋亡率明显增加（P<0.05）;p62（P<0.05）、Bcl-2（P<0.05）蛋白明显降低,Beclin1（P<0.05）、LC3II/LC3I（P<0.05）、Bax（P<0.05）蛋白表达明显增加。结论:1.ZNRF2 mRNA和蛋白在OGD/R处理的皮层神经元中显著降低2.OGD/R处理的皮层神经元中自噬过度激活3.ZNRF2明显改善OGD/R导致的皮层神经元损伤4.ZNRF2保护OGD/R导致的皮层神经元损伤可能与抑制m TORC1介导的神经元自噬激活相关