多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种高度异质性的内分泌代谢紊乱性疾病,以稀发排卵或无排卵、高雄激素血症和卵巢的多囊性改变为主要临床特征,是临床上最常见的女性生殖内分泌疾病。PCOS的发病机制非常复杂,是遗传因素和环境因素共同作用的结果。近期有学者认为,PCOS也是一种胎源性疾病,子宫内高雄激素环境、母亲肥胖、胎儿的生长方式和低出生体质量等多种因素,可能干扰胎儿下丘脑—垂体—卵巢轴和内脏靶器官的生理发育过程,导致下丘脑对类固醇激素的负反馈调节敏感性下降和胰腺功能受损,造成青春期或成年后出现各种PCOS症状。PCOS患者多自青春期前后发病,糖脂代谢异常是青春期PCOS患者最早出现的症状之一,胰岛素抵抗在青春期PCOS发病过程中起重要作用。由于胰岛素抵抗的存在,机体代偿性高胰岛素血症引起卵巢雄激素的分泌异常增加,导致卵泡提前闭锁,干扰卵泡发育和正常排卵。此外,胰岛素抵抗的持续发展与肥胖、2型糖尿病、代谢综合征以及心血管疾病的发病密切相关。由于正常青春期发育过程中出现不规则排卵、生理性胰岛素抵抗、高雄激素血症以及多囊卵巢的形态学特点与PCOS的临床特征十分相似,对青春期PCOS患者的诊断存在一定的难度。因此,明确青春期PCOS的早期发病机制,对早期预防、诊断和治疗青春期PCOS以及防止远期并发症的发生具有重要的临床意义。本研究通过对妊娠晚期大鼠皮下注射双氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)建立子代青春期PCOS大鼠模型,探讨宫内高雄激素环境暴露对子代青春期PCOS大鼠的生长发育、类固醇激素分泌和糖脂代谢的影响,阐明子代青春期PCOS发生胰岛素抵抗的潜在机制。此外,对下丘脑Kisspeptin/Neurokinin B/Dynorphin(KNDy)信号系统在青春期PCOS大鼠Gn RH释放过程中的调节作用进行初步研究。第一部分宫内高雄激素暴露对子代青春期雌鼠生殖与糖脂代谢的影响目的观察宫内高雄激素暴露对子代青春期雌鼠生长发育、生殖内分泌和糖脂代谢的影响。方法在大鼠妊娠第16至19天颈背部皮下注射0.5 ml双氢睾酮(DHT)油剂(10mg/ml)或0.5 ml溶剂。从子代雌鼠出生后第4~8周,收集血清和组织标本,观察雌性后代体重增长、卵巢重量和卵巢的形态学改变,并检测血清生殖内分泌激素水平和糖脂代谢相关指标。结果DHT处理组的子代雌鼠在青春期体重增长明显快于对照组(P<0.01),其卵巢内有大量卵泡成囊状改变,卵泡总数、囊状卵泡和闭锁卵泡的数量较对照组明显增多(P<0.01),但卵巢重量和卵巢重量/体重比两组间无显著差异。从出生后4周到8周,DHT处理组的子代雌鼠血清睾酮和雌二醇水平与对照组比较无显著差异(P>0.05)。5周龄至8周龄DHT处理组子代雌鼠空腹血糖、胰岛素和瘦素水平均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05),稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)亦显著增高(P<0.01或P<0.05)。从出生后4周到7周,两组雌鼠血清总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸无显著差异,但8周龄DHT处理组雌鼠游离脂肪酸水平明显高于同龄对照组大鼠(P<0.05)。第二部分宫内高雄激素暴露诱发子代青春期PCOS大鼠胰岛素抵抗的机制研究目的观察宫内高雄激素暴露对子代青春期雌鼠糖耐量和胰岛素敏感性的影响,探讨青春期PCOS大鼠发生胰岛素抵抗的机制。方法如前文建立子代青春期PCOS大鼠模型。雌性子代大鼠分别于出生后第5~8周行腹腔葡萄糖耐量实验,在注射葡萄糖前和注射后第15、30、60和120min测定血糖和胰岛素水平。对4周至8周龄的PCOS大鼠和对照组雌鼠进行腹腔胰岛素耐量实验,在注射胰岛素前和注射后第15、30、60和120min测定血糖水平。此外,取6周龄PCOS大鼠和对照组雌鼠腹腔注射人常规胰岛素(2 U/kg),对骨骼肌、肝脏和腹部脂肪组织内IRS1、IRS2、AKT、GSK-3蛋白及其磷酸化水平变化进行检测。结果葡萄糖耐量实验结果显示,在出生后5~8周,PCOS大鼠腹腔注射葡萄糖后第15、30、60和120 min的血糖和胰岛素水平与对照组相比并无明显差异(P>0.05)。胰岛素耐量实验结果显示,DHT组和对照组子代雌鼠血糖在腹腔注射胰岛素后均明显下降,5周龄和6周龄PCOS大鼠注射胰岛素后第60min的血糖水平明显高于同龄对照组雌鼠(P<0.01或P<0.05);7周龄和8周龄DHT处理组子代雌鼠在注射胰岛素后第30和60 min的血糖水平明显高于同龄对照组子代雌鼠(P<0.05)。腹腔注射胰岛素后,青春期PCOS大鼠骨骼肌和肝脏组织内IRS1和IRS2蛋白表达水平较对照组明显下降(P<0.01),骨骼肌组织内AKT磷酸化水平显著降低(P<0.01);而脂肪组织内胰岛素信号通路的IRS1、IRS2、AKT、GSK-3蛋白及其磷酸化水平无显著改变(P>0.05)。第三部分宫内高雄激素暴露对子代青春期PCOS大鼠下丘脑KNDy神经元的影响及其机制研究目的观察宫内高雄激素暴露对子代青春期雌鼠下丘脑KNDy信号系统的影响,分析下丘脑KNDy神经元在调节青春期PCOS大鼠Gn RH和LH分泌中的作用。方法如前文构建子代青春期PCOS大鼠模型。测定4周龄、6周龄和8周龄PCOS大鼠血清LH水平,检测其下丘脑弓状核内Kiss1、kiss1r、NKB、NKB3R、NPY、NPYR、Ob Rb、Gn RH、Ag RP和POMC m RNAs表达水平。通过免疫荧光染色方法,观察Kisspeptin、NKB和Ob Rb在6周龄PCOS大鼠下丘脑弓状核内的表达定位。采用侧脑室灌注术分别将Kisspeptin、Senktide(NKB受体激动剂)和Leptin注入6周龄PCOS大鼠和对照组子代雌鼠侧脑室内,观察注药后15、30和60分钟血清LH水平的变化,并检测下丘脑弓状核Kiss1、NKB和Ob Rb m RNA表达水平的改变。结果4周龄、6周龄和8周龄PCOS大鼠血清LH与同龄对照组雌鼠比较无显著性差异,但6周龄PCOS大鼠血清LH脉冲释放频率明显高于对照组雌鼠(P<0.01)。在出生后第4周,PCOS大鼠下丘脑弓状核Kiss1 m RNA表达水平与对照组雌鼠相比无明显差异,但6周和8周龄PCOS大鼠弓状核Kiss1 m RNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01)。与对照组比较,4周、6周和8周龄PCOS大鼠弓状核NKB m RNA表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);PCOS大鼠弓状核NKB3R m RNA表达在出生后第4周明显高于对照组(P<0.05)。4周和6周龄PCOS大鼠弓状核Ob Rb m RNA表达水平也较对照组明显增加(P<0.05)。4周、6周和8周龄PCOS大鼠下丘脑弓状核kiss1r、NPY,NPYR、Gn RH、Ag RP和POMC m RNAs表达水平与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。免疫荧光染色结果显示,6周龄PCOS大鼠下丘脑弓状核内有大量Kisspeptin和NKB神经元,Kisspeptin和NKB神经元内均有Ob Rb的表达。6周龄PCOS大鼠侧脑室内注射Kisspeptin、Senktide和Leptin 15、30和60 min后,血清LH水平均较注射生理盐水组明显升高(P<0.05或P<0.01)。在侧脑室注射Leptin 60min后,6周龄PCOS大鼠下丘脑弓状核Kiss1 m RNA表达水平较生理盐水组显著升高(P<0.01),但NKB m RNA表达水平与生理盐水组无显著差异。结论1.本研究通过对妊娠晚期大鼠皮下注射双氢睾酮,成功构建子代青春期PCOS大鼠模型。该模型表现与青春期PCOS患者类似的生殖和代谢异常,包括卵巢多囊样改变、体重增长加快、血糖升高、高胰岛素血症、高瘦素血症和胰岛素抵抗。该模型为研究青春期PCOS的病因和病理生理机制奠定了基础。2.本研究系统地观察宫内高雄激素暴露对青春期PCOS大鼠糖耐量和胰岛素敏感性的影响。研究结果显示,宫内高雄激素暴露导致青春期PCOS大鼠胰岛素敏感性下降,并随年龄的增长有加重趋势,PCOS大鼠骨骼肌和肝脏组织内IRS-AKT胰岛素信号通路异常可能是引起胰岛素抵抗的原因之一。阐明子代青春期PCOS大鼠发生胰岛素抵抗的潜在机制,为研究人类青春期PCOS患者胰岛素抵抗的发生提供新的思路。3.暴露于宫内高雄激素环境导致子代青春期雌鼠血清LH脉冲释放频率增加,下丘脑弓状核Kisspeptin、NKB和Leptin受体的表达升高。Kisspeptin、NKB受体激动剂和Leptin均刺激青春期PCOS大鼠LH的释放,Leptin促进下丘脑弓状核Kiss1的表达。因此,Kisspeptin、NKB神经元与Leptin可能协同参与调控青春期PCOS大鼠GnRH和LH的脉冲释放。4.上述研究结果证实,胎儿期暴露于宫内高雄激素环境对日后发生PCOS产生直接的影响。本研究初步阐明青春期PCOS作为一种胎源性疾病的病理发生发展机制,为早期预防、诊断和治疗青春期PCOS以及防止远期并发症提供理论依据。