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RNAi(RNA interference,RNAi)技术是一种特异、高效沉默基因的新方法,但小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染效率低,半衰期短、体循环中极易被降解,长期稳定生效必须借助载体。阳离子聚合物制成的纳米粒子做为新型的基因载体包裹DNA或RNA后,可有效增加核苷酸进入细胞的量;保护核苷酸,使其免遭核酸酶的降解,增强稳定性。本研究以生物可降解的三嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(monomethoxypoly(ethyleneglycol)-poly(lactic-co-glycolic acid)-poly L-lysine,mPEG-PLGA-PLL)为骨架,构建包裹荧光分子探针Cy3标记的siRNA载基因纳米粒子。探讨超声辐照微泡造影剂SonoVue促进载Cy3-siRNA纳米粒子转染鼠源性视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞和大鼠视网膜组织的可行性;探索超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted microbubbledestruction,UTMD)的物理方法与生物可降解的纳米粒载体联合应用增强基因递送的新途径,并利用荧光分子探针精确定位纳米粒子在细胞和活体内的分布,揭示UTMD基因递送系统增强载基因纳米粒子递送的可能分子生物学机制。主要包括以下四方面内容: 第Ⅰ部分载Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒的制备与表征 目的:以生物可降解三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL为骨架,构建包裹荧光分子探针Cy3标记的siRNA载基因纳米粒子。并对其形态、粒径大小及表面电荷分布进行表征,检测基因包封率和体外释放规律。 方法:采用复乳法制备载Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒,扫描电镜和电位/超细微粒粒度分析仪对所构建的载基因纳米粒进行表征,高效液相色谱法测定纳米粒子内siRNA的包封率及体外释放规律,琼脂糖凝胶电泳阻滞实验进一步考察纳米材料与siRNA的结合能力。 结果:扫描电镜证实载Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒呈球形,表面光滑,分布均匀;纳米粒子的平均直径是151±74 nm:Zeta电位为-0.13 mV,高效液相色谱测得包封率为86.06％,在10天内,纳米粒子可以长期稳定的释放siRNA,累计释放量86.13±3.06％。当三嵌段聚合物mPEG-PLGA-PLL与siRNA的比例为600:1时,电泳阻滞实验显示纳米材料可以完全捆绑siRNA。 结论:采用复乳法本实验成功合成了包载Cy3-siRNAmPEG-PLGA-PLL纳米粒。纳米粒的包载率和体外释放规律,理论上能达到治疗要求,为进一步的实验打下了基础。 第Ⅱ部分载Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒体外基因沉默效果和细胞毒性 目的:探讨所制备的mPEG-PLGA-PLL纳米粒能否有效介导Cy3-siRNA分子转染体外培养的细胞,沉默靶基因的表达,并考察其细胞毒性。 方法:将稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的人肺癌细胞株SPC-A1-GFP以每孔1×105个接种于24孔培养板,利用mPEG-PLGA-PLL纳米粒介导荧光分子探针Cy3标记的GFP siRNA转染SPC-A1-GFP细胞(纳米粒子用量为0.6 mg/孔,浓度为1.2 mg/mL,包含siRNA0.8μg),并以携带相同量Cy3-GFP siRNA的脂质体载体LipofectamineTM2000及单纯的siRNA为对照,加入转染试剂后,每孔加入一定量不含胎牛血清的培养基,确保液体总量为500μl。转染后12h,利用倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察细胞内Cy3-GFPsiRNA的摄取,流式细胞仪检测不同实验组SPC-A1-GFP细胞Cy3-GFPsiRNA摄取效率及荧光强度。转染后48 h,使用倒置荧光显微镜观察SPC-A1-GFP细胞绿色荧光蛋白的沉默效果,流式细胞仪检测基因表达抑制效率。实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测转染后SPC-A1-GFP细胞内GFPmRNA的变化,并用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测纳米粒子的细胞毒性。 结果:流式细胞仪检测结果显示载Cy3-GFP siRNA纳米粒子组细胞Cy3-siRNA摄取率明显高于Lipofectamine-siRNA复合物组(92.17±2.54％vs74.63±3.84％),二者之间有明显统计学差异(P＜0.001)。而单纯siRNA组细胞浆内仅观察到少量的Cy3-siRNA,摄取率为9.33±2.55％。转染48 h后,载GFP siRNA纳米粒子组基因沉默效率为33.71％,而Lipofectamine-siRNA组为25.42％,两组相比有明显统计学差异(P=0.004)。RT-PCR分析结果显示,载Cy3-GFP siRNA纳米粒子组较其它实验组具有更高的抑制效能,GFP mRNA转录抑制率为56.33％,明显高于Lipofectamine-siRNA组的43.72％(P=0.006),而单纯Cy3-GFPsiRNA组没有明显的基因沉默效果。MTT结果显示载siRNA纳米粒子组细胞生长受到轻度抑制,存活率为89.64±3.20％,Lipofectamine-siRNA组细胞存活率降低更为明显为86.39±2.84％,两者比较无显著差异(P=0.268),但均低于对照组(P=0.005;P=0.001)。 结论:与LipofectamineTM2000相比,mPEG-PLGA-PLL纳米粒具有更高的siRNA递送和基因沉默效能,高浓度状态下细胞毒性较低,表明生物可降解的三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL纳米粒可以作为安全有效的非病毒载体增强siRNA的递送和基因沉默效果。 第Ⅲ部分超声辐照微泡造影剂SonoVue促进载Cy3-PDGF BBsiRNA纳米粒转染RPE细胞的实验研究 目的:探讨超声和/或微泡造影剂SonoVue促进载Cy3-PDGF BB siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒转染RPE-J细胞的可行性。 方法:0.1 mg/mL的载Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒与RPE-J细胞一起孵育,不同超声和/或微泡造影剂SonoVue转染条件下,利用倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪观察测定细胞转染12h后对纳米粒子的摄取效果,筛选超声和/或微泡造影剂介导载Cy3-PDGF BB siRNA纳米粒转染RPE-J细胞的最佳转染条件。RT-PCR法检测最佳转染条件处理后第1,2,4,6,8天RPE-J细胞内PDGF BB mRNA的变化。MTT法检测不同条件下转染48 h后细胞增殖情况。 结果:转染12 h后,荧光显微镜和流式细胞仪检测证实低强度超声或者15-20％微泡可以安全有效增强低浓度载Cy3-siRNAmPEG-PLGA-PLL纳米粒转染RPE-J细胞,然而,在超声及微泡最优的转染条件下,两者联合应用没有进一步增强细胞对纳米粒子的摄取(P=0.072;P=0.488)。在最优的超声增强纳米粒子递送条件下,超声和载Cy3-PDGF BB siRNA mPEG-PLGA-PLL纳米粒联合应用明显降低了RPE-J细胞内PDGF BB基因mRNA及蛋白的表达水平。 结论:低强度超声或15-20％微泡可以安全有效的增强载Cy3-siRNA纳米粒子递送到RPE-J细胞,超声辐照的物理方法与mPEG-PLGA-PLL纳米粒载体联合应用可以更为有效的下调目的基因的表达。 第Ⅳ部分 UTMD促进载Cy3-siRNA纳米粒体内转染大鼠视网膜的实验研究 目的:探讨UTMD物理方法促进载Cy3-siRNA纳米粒体内转染大鼠视网膜的有效性和安全性。 方法:50只Wistar大鼠随机分为5组:单纯对照组;NPs+NS;NPs+MBS;NPs+NS+US;NPs+MBs+US(UTMD)。对照组每只大鼠左眼注射0.9％氯化钠溶液15μl:4个实验组每只大鼠左眼注射12μl载Cy3-siRNA纳米粒和3μl NS或MBs的混合液,即玻璃体腔内均注射15μl的转染液。超声辐照条件为:1MHz,PRF100 Hz,2 W/cm2,50％的脉冲波,辐照时间5 min。转染24 h后,视网膜组织铺片观察Cy3-siRNA转染阳性细胞的形态、强度及分布范围。流式细胞仪测定视网膜单细胞悬液Cy3-siRNA转染阳性细胞的百分率。病理切片观察视网膜组织有无损伤。 结果:视网膜组织铺片及流式细胞仪测定结果显示UTMD组阳性细胞的数量及荧光强度均高于其它四组(P＜0.05);UTMD组的组织切片显示细胞排列整齐,层次清晰,无明显炎症细胞浸润。 结论:UTMD技术在体内能安全有效地促进载Cy3-siRNAmPEG-PLGA-PLL纳米粒转染大鼠视网膜。