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21世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功，但基因治疗的成功与否很大程度上依赖于载体的发展。无论是具有治疗作用的编码特定蛋白的DNA片段，或是能特异封闭靶基因表达的RNA片段或寡核苷酸(ODN)片段，都必须定位于细胞核或细胞浆方能发挥疗效。由于这些核酸为高度亲水性的大分子物质，表面带有很强的负电荷，且易被核酸酶所降解，生物半衰期短，因此基因治疗的关键问题是如何有效的将目的基因输入至特定的靶部位，即基因的传递。构建安全有效的基因载体是基因治疗的关键，也是药剂学中新兴的研究领域。病毒类载体具有很强的免疫原性，且存在与宿主细胞整合的严重危险性。脂质体、纳米粒、胶团等非病毒类载体由于较好的安全性，是目前基因载体的研究热点，但与病毒类载体相比，转染效率显著低下是急需解决的问题。本课题为改善非病毒类载体的细胞摄取和转染效率，以反义核酸和编码报告基因的质粒为模型，研究阳离子脂质体载体的组成和结构对细胞摄取核酸和基因转染的影响，为设计合理的基因载体提供理论依据和实践基础。 为筛选出能有效促进细胞摄取ODN的阳离子脂质体，通过细胞摄取效率为评价指标，以荧光标记的反义寡核苷酸(FAM-ODN)为模型，与阳离子脂质体混合得到脂质体/ODN复合物。比较了脂质体的组成、脂质体和ODN的相对用量(以+/-电荷比例表示)对细胞摄取ODN效率的影响。结果表明，阳离子脂质因结构的差异可影响脂质体与ODN的结合能力，产生不同的凝胶电泳行为。十八酰胺(SA)脂质体/ODN复合物电泳后，ODN的条带位置和亮度均与对照相同，而3β[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)脂质体/ODN复合物电泳后则在点样孔出现滞留。SA脂质体对细胞摄取ODN的促进作用较弱，最大促进作用为游离ODN的2.57倍。DC-Chol脂质体可同时显著性提高阳性细胞百分率和平均荧光强度，当+/-电荷比为2∶1，细胞总荧光强度比对照组增加了80倍，且该脂质体稳定性良好，对细胞没有毒性。 通过处方筛选，制备了能够有效促进细胞摄取ODN的DC-Chol脂质体，研究DC-Chol脂质体/ODN复合物的性质及影响细胞摄取的各种因素。复合物的粒径和载药率与+/-电荷比有关。空白DC-Chol脂质体的粒径为162.3 nm，复合物的粒径随+/-电荷比增加先增大后减少:载药率则随+/-电荷比的增加逐渐增大，后达到恒定。当+/-电荷比为2∶1时，粒径为987.3 nm，载药率为93.3％。细胞摄取效率和毒性随+/-电荷比的增加而增大。除+/-电荷比外，摄取效率尚受细胞株、培养条件等因素的影响。在相同的+/-电荷比时，不同细胞摄取效率和毒性各不相同。当培养体系置4℃时，DC-Chol脂质体介导的细胞摄取能力显著下降，显示脂质体主要通过内吞途径携带核酸进入细胞。激光共聚焦显微镜观察可见细胞摄取的脂质体/ODN复合物分布在整个细胞中。血清可以使细胞摄取效率下降。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳发现DC-Chol脂质体/ODN复合物有部分易被RNaseⅠ降解，而另一部分的ODN则免遭核酶的降解。结合凝胶电泳、载药率测定和抗核酶降解实验，推断ODN在DC-Chol脂质体混悬液中有三种可能存在的方式:游离的ODN、吸附在DC-Chol脂质体表面的ODN、包裹在DC-Chol脂质体内部的ODN，且包裹在DC-Chol脂质体内部的ODN量随+/-电荷比增加而增多。 为进一步提高脂质体介导的细胞摄取效率，在DC-Chol脂质体基础上，考察了不同表面活性剂和吸收促进剂(Pluronic、聚山梨酯-80、Azone)修饰的脂质体对细胞摄取的影响。结果发现，聚山梨酯-80修饰的DC-Chol脂质体，可使小鼠MФ细胞摄取微粒的效率显著下降，而用Pluronic修饰的脂质体载药率虽有不同程度下降，但可进一步增加细胞对ODN的摄取，细胞总荧光强度比对照DC-Chol脂质体提高了1.7～2.3倍。Pluronic修饰的DC-Chol脂质体促进效果与其结构中疏水性的聚氧丙烯(PPO)单元数和HBL值有关。结构中含有PPO单元多的Pluronic修饰的脂质体促进作用比PPO单元少的明显，含相同数目的PPO，具有较适宜PEO/PPO比例的Pluronic更利于细胞摄取。 以pEGFP-N1质粒为报告基因，COS-7为模型细胞，结合荧光显微镜观察和流式细胞仪定量测定，研究影响阳离子脂质体介导基因转染效率的因素。结果表明，以DC-Chol与人豆卵磷脂(SPC)和DC-Chol与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)制备的两种脂质体均能够有效的促进细胞摄取ODN，但DC-Chol/ DOPE脂质体的转染效率显著高于DC-Chol/ SPC脂质体，表明脂质体组成中的中性磷脂对转染效率也有重要影响。pEGFP-N1质粒编码的目标蛋白——绿荧光蛋白表达后充满整个胞浆，转染效率具有DNA剂量依赖性，最佳转染时间为（24.48）小脂质体对细胞摄取增加的倍数高于转染效率增加的倍数，表明在阳离子脂质体的介导下，进入细胞内的DNA并不都能表达目标蛋白，故细胞转染尚与胞内转运和细胞所处的周期有关。通过阳离子聚合物压缩DNA，再与阳离子脂质体组装成阳离子聚合物/DNA/阳离子脂质体的三聚体，其转染效率取决于阳离子聚合物/DNA复合物的结合和解离性能。 采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法研究质粒DNA在家兔体内的药动学。以PBK-HBV质粒为报告基因，比较游离的质粒和阳离子脂质体对质粒的药动学性质。结果表明，FQ-PCR测定血中报告基因不受血清影响，反应循环数(Nc)与标准DNA浓度的对数(logC)成线性关系，最低检测浓度为12.8 pg/ml。FQ-PCR能够快速、定量和有效的测定血中DNA，具有灵敏度高、专属性强和线性范围广的优点。DNA溶液、DC-Chol脂质体/DNA复合物和聚山梨酯-80修饰的DC-Chol脂质体/DNA复合物静脉注射后，血药浓度符合二室模型，分布半衰期T1/2α分别为0.88±0.12 min、0.21±0.16 min和0.42±0.32 min，消除半衰期T1/2β分别为7.69±1.67 min、23.70±6.34 min和37.96±8.89 min;血中DNA的平均滞留时间MRT分别为1.74±0.26 min、38.45±18.44 min和52.36±18.83 min。两种脂质体组和DNA溶液组的T1/2β和MRT均有显著性差异(p＜0.05和p＜0.01)。阳离子脂质体可以显著延长DNA在血中的存留时间。 本课题通过对阳离子脂质体及脂质体/ODN复合物的组成对细胞摄取影响的研究，发现脂质体中阳离子脂质的差异对细胞摄取效率有很大影响;发现脂质体/ODN复合物中的部分ODN包裹在脂质体的内部，并能够有效的抵抗核酸酶的降解;通过对脂质体表面的修饰可以改变细胞摄取微粒的行为，以Pluronic修饰的脂质体能够进一步增加细胞摄取效率，发现Pluronic修饰的脂质体的细胞摄取效率与Pluronic的分子结构有关;通过优化阳离子脂质体介导细胞转染条件，发现阳离子聚合物/DNA复合物的结合和解离性能是影响阳离子聚合物/DNA/阳离子脂质体三聚体转染效率的重要因素;建立了荧光定量PCR的分析方法，研究DNA及其阳离子脂质体/DNA复合物的在家兔体内的药动学性质，阳离子脂质体能够显著增加DNA在体内的存留时间，用聚山梨酯-80修饰可进一步延长脂质体在体内的停留时间。