论文部分内容阅读
研究背景：
甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”,为一种新型毒品,号称“毒品之王”。因其具有见效快,兴奋作用维持时间长,价格低廉,化学合成技术简单,多途径摄取等特点,使它滥用和蔓延速度极快。因其具有中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感能效应等药理、毒理学特性,最初作为抗疲劳剂、减肥药使用。随后发现其具有精神依赖性。现已被列为联合国精神药品公约管制的精神活性物质。研究证明,METH可导致行为学改变,对心、肝、肾和骨骼肌等组织器官均有毒性作用,但更主要的是其对中枢神经系统的毒性,尤其是多巴胺能系统。METH可导致大脑黑质、纹状体、海马、皮质等多部位损伤,包括神经细胞凋亡、多巴胺耗竭、多巴胺能神经末梢损害、多巴胺转运体(DAT)减少和酪氨酸羟化酶活性下降。研究显示METH可导致体外培养的神经细胞凋亡,表现为细胞核染色质凝集、核碎裂和阶梯状DNA碎片形成。METH的毒性损伤作用是一个复杂过程,目前认为METH毒性损伤所致的过量多巴胺的氧化、谷氨酸介导的兴奋性作用、线粒体功能紊乱、神经元凋亡、细胞稳态改变及神经退行性变是METH导致中枢神经损伤的可能机制,但目前国内外的研究结果尚不足以完全阐明确切METH的神经毒性机制。
目的：
我们前一阶段的体内实验研究结果显示METH引起大鼠脑组织多部位神经毒性损伤,多巴胺及代谢产物的耗竭,纹状体NOS活性升高,NO含量提高,小胶质细胞激活等。运用蛋白质组学的方法,对METH注射后大鼠纹状体、皮质、海马等部位部位的差异表达蛋白质进行鉴定和分析,寻找和鉴定出30个差异表达蛋白点,3个NO相关蛋白即硝化蛋白。分析认为氧化应激、能量代谢障碍、蛋白酶体功能失调、凋亡及重要结构蛋白的硝化等可能是METH神经毒性的主要机制。为了更好更深入的研究METH的神经毒性机制,本次研究采用多巴胺能神经元体外模型PC12细胞系进行体外实验。PC12细胞在神经生长因子等诱导后,形态学及功能方面向交感神经元分化,由于该神经元特性,目前已做为一个广泛使用的神经元体外模型,用于神经生物、中枢神经系统疾病、神经毒素等方面的研究,也是一个可行的神经蛋白组学研究模型。因此,我们运用PC12细胞系进行METH体外损伤实验,初步探讨METH对PC12细胞的毒性损伤作用,并在此基础上运用分子生物学、蛋白质组学及质谱分析技术,对METH作用PC12后的差异表达蛋白点进行筛选和鉴定,以期在体内实验基础上筛选出新的差异表达蛋白点,并根据蛋白质功能,进一步探讨METH的神经毒性机制。此外,也为PC12细胞系在后续METH体外研究提供基础。
方法：
1.METH对PC12细胞毒性损伤的研究
采用已分化的PC12细胞,用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清,1:100双抗)进行培养,将细胞置于37℃,5％CO2的培养箱中,细胞生长至对数生长期,达80％汇合后进行实验。实验分为对照组(0 mmol/L)和实验组,即0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L及2.5 mmol/LMETH组。细胞80％汇合后实验组分别用上述不同浓度METH处理,对照组加入等体积的DMEM培养液,继续培养24h。24h后,倒置显微镜下观察PC12细胞形态改变,MTT法检测细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞早期凋亡率,NO检测试剂盒硝酸还原酶法检测细胞上清液NO含量。取2.5mmol/LMETH处理的PC12细胞用NOS检测试剂盒检测NO上游NOS活力,western blot技术检测细胞NO下游产物硝基酪氨酸即3-NT表达水平。
2.METH诱导PC12细胞损伤的差异蛋白质的筛选与鉴定细胞培养方法同前。细胞生长至对数生长期,达80％汇合后,实验组给予2.5mmol/LMETH处理,对照组加入等体积DMEM培养液。METH处理PC12细胞24h后,去除培养基,胰酶消化收集细胞,冷PBS洗两次,3000r/min离心5min,去上清残留细胞团块。根据细胞团块大小加入样本裂解液(尿素8M、CHAPS4％(w/v)、DTT40mM、IPG buffer2％(v/v)、1％PMSF),室温变性30min,4℃12000r/min离心20min,提取细胞总蛋白质。丙酮沉淀法去除蛋白中杂质。Braford法对蛋白质进行定量。应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离蛋白质,IamgescannerⅢ透射扫描仪获取凝胶图谱。用ImageMaster7.0软件对实验组和对照组2-DE图谱进行分析,根据蛋白质点Vol％值寻找出差异表达蛋白点。切取差异蛋白质点,经胶内酶切、肽段抽提后用MALDI-TOF质谱仪获取肽质量指纹图谱(PMF),使用Mascot软件对质谱的PMF进行数据库检索比对,采用MS和MS/MS联合模式搜索NCBInr大鼠数据库,鉴定出差异蛋白点。最后,在ExPASy(Expertprotein analysis system)swiss sprot蛋白数据库中搜索蛋白质的信息,根据蛋白质的功能,分析其与METH神经毒性可能存在的关系,进一步探讨METH神经毒性机制。
结果：
1.以0mmol/LMETH组为对照组,经0.5-2.5mmol/LMETH处理的PC12细胞,24h倒置显微镜下可见PC12细胞胞体变圆,神经突起变短、断裂至消失,神经网络逐渐消失,细胞边缘不清,呈毛刺样,以2.0和2.5mmol/L组尤为明显,且细胞损伤随METH浓度增加呈增强趋势。MTT法检测PC12细胞活力随METH浓度的升高而逐渐下降,与对照组相比均有显著性差异(P<0.01)；细胞凋亡率在0.5-1.5mmol/L浓度范围内逐渐升高,至2.0mmol/L时凋亡率较前下降,但与对照组相比均升高,且与对照组相比有显著性差异(P=0.000)；各组细胞培养液NO含量随METH浓度增加逐渐升高,变化具有显著性差异(P=0.000)。与对照组相比,2.5mmol/LMETH处理的PC12细胞内TNOS活力显著增加(P=0.000)；western-blot技术检测细胞3-NT水平较对照组升高。
2.应用双向凝胶电泳结合质谱分析技术,共鉴定出18个差异表达蛋白点,其中8个差异蛋白点在METH作用后表达增加,10个差异蛋白点表达减弱。通过对蛋白质功能分析,发现这些蛋白质主要包括细胞骨架蛋白(Dynactin subunit2,Macrophage-capping protein,Actin,Tubulin alpha-1B chain,Tubulin beta-2B chain,Gelsolin),分子伴侣(Heat shock protein HSP90-beta,Heat shock cognate71 kDaprotein,T-complex protein1 subunit alpha),与氧化应激和凋亡相关的蛋白(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Gelsolin,Ras-related C3 botulinumtoxin substrate1,Cystatin-B),参与能量代谢的酶类(Pyruvate kinase isozymesM1/M2,Creatine kinase B-type,Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Malate dehydrogenase)。
结论：
1.METH对PC12细胞具有毒性作用,能导致细胞形态学改变,并随着METH浓度升高细胞形态损伤呈增强趋势。
2.METH能导致细胞活力下降,诱导细胞凋亡,使细胞NO含量和NOS活力增加,3-NT表达水平增强。凋亡及NO过量所致的氧化应激参与了METH对PC12细胞的毒性损伤作用。
3.METH作用PC12细胞的差异蛋白质表达变化参与了氧化应激、凋亡、细胞骨架损伤、酶活性失调所致的能量代谢障碍,可能是METH神经毒性的重要机制。