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目的:为了将肺癌靶向治疗和自体免疫增强疗法相结合,本研究扩增血管内皮生长因子(VEGF)和次级淋巴组织趋化因子(SLC)的融合基因,构建VEGF-SLC融合基因的原核表达质粒pQE30-VEGF-SLC,在E.coli中高效表达和纯化重组VEGF-SLC融合蛋白,并在体外检测其生物学活性,为研究和开发新型靶向肿瘤生物制剂奠定基础。方法:1.以A549细胞mRNA为模板,RT-PCR扩增VEGF基因片段,以pET32a(+)/SLC质粒为模板,PCR扩增SLC基因片段,再以Gene SOEing法扩增VEGF-SLC融合基因,然后将其插入原核表达质粒pQE30中,构建重组质粒pQE30-VEGF-SLC。重组质粒经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化E.coli M15,用IPTG诱导目的基因表达。Western bolt鉴定后,采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,然后采取逐步降低尿素浓度的方法使重组蛋白复性。2.用不同浓度梯度的重组蛋白及阴性对照包被96孔板,经封闭洗涤后分别与A549细胞和对照MRC-5共培养1h,结晶紫染色,观察重组蛋白VEGF-SLC对细胞的粘附情况,通过细胞粘附实验评价重组蛋白的肿瘤靶向性。3.将不同浓度梯度的重组蛋白及阴性对照加到96孔板中,每组各设3复孔,每孔上室加入人外周血淋巴细胞悬液孵育4h后,显微镜下观察细胞迁移情况并计数,计算趋化指数,通过趋化实验检测重组蛋白对外周血淋巴细胞的趋化能力。结果:1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pQE30-VEGF-SLC原核表达质粒构建成功;将重组质粒转化大肠杆菌M15后、经IPTG诱导表达,获得了重组VEGF-SLC融合蛋白(rVEGE-SLC)。融合蛋白经SDS-PAGE分析,分子量约为28KDa,主要以包涵体形式存在,通过6×His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,重组蛋白纯度达90%以上。2.在细胞粘附实验中,被rVEGF-SLC融合蛋白包被的孔内明显有A549细胞粘附。粘附的细胞数量随rVEGF-SLC融合蛋白浓度增加而增多。阴性对照孔和MRC-5对照细胞孔无明显细胞粘附。3.在趋化实验中,rVEGF-SLC融合蛋白能引起人外周血淋巴细胞发生明显的迁移,并在3μg/L时达到最大趋化指数。结论:1.成功构建pQE30-VEGF-SLC原核表达质粒,且能在大肠杆菌M15中高效表达重组VEGF-SLC融合蛋白,为探索肿瘤生物治疗新途径奠定了基础。2. rVEGF-SLC融合蛋白在体外对人肺腺癌A549细胞具有明显的粘附作用,但是对人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞(非肿瘤对照细胞)且无明显粘附效应,证实了其肿瘤靶向性;趋化实验证实,rVEGF-SLC融合蛋白对人外周血淋巴细胞具有明显的趋化效应。因此,本实验重组表达的rVEGF-SLC融合蛋白兼具天然VEGF和SLC各自的生物学活性。该肿瘤靶向性融合蛋白的制备和研究,为探索肺癌及其它肿瘤的靶向治疗和免疫治疗综合途径奠定了基础。