论文部分内容阅读
目的研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离培养及向胰岛素分泌细胞的定向诱导分化和鉴定方法,为糖尿病的治疗提供种子细胞来源。方法1.分别采用全骨髓培养法与Percoll密度梯度离心法从成人骨髓中分离MSCs,相同条件下体外培养,比较两种方法所获得的贴壁细胞克隆数、细胞形态、细胞表面标志及向脂肪细胞的分化情况。2.将全骨髓培养法获得的MSCs体外培养传代,取3～5代细胞先后予以2-巯基乙醇、谷氨酰胺、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及尼克酰胺等,通过三阶段向胰岛样细胞定向诱导分化。3.相差显微镜下观察MSCs在诱导前后的形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)的表达、双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞团、电化学发光法测定胰岛素的分泌量。结果1.全骨髓培养法获得的贴壁细胞克隆数明显多于Percoll密度梯度离心法(P＜0.05)。两种方法获得的人MSCs形态无明显差异,CD44阳性表达率和CD34阴性表达率差异无统计学意义(P＞0.05),经地塞米松、胰岛素诱导后均可分化为脂肪细胞。2.MSCs经2-巯基乙醇、尼克酰胺等诱导后,细胞逐渐变圆,诱导二阶段细胞表达PDX-1,诱导三阶段形成胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,葡萄糖刺激有胰岛素释放;而未经诱导的MSCs呈长梭形贴壁生长,无PDX-1表达,双硫腙染色阴性,无胰岛素释放。结论1.与Percoll密度梯度离心法比较,全骨髓培养法是更为简便、实用的MSCs体外分离方法之一。2.2-巯基乙醇、谷氨酰胺、EGF、bFGF及尼克酰胺等可在体外诱导成人MSCs转分化为胰岛素分泌细胞。