Zfy (Zinc-finger Y)基因位于Y染色体的短臂上，是一段可编码锌指蛋白的高度保守基因序列。Zfy基因具有特定的核定位信号区域，能够特异性的引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作用，与Y精子的结构和功能发挥有关。本研究根据Zfy基因特点，通过设计shRNA片段，对绵羊的Zfy基因进行细胞水平上的RNAi实验，通过qRT-PCR分析后，选取对Zfy基因mRNA表达水平抑制率最高的片段，通过睾丸注射法注射给雄性公羊，人工授精后，统计经干扰后后代的性别比例。具体研究结果如下：1.绵羊Zfy基因cDNA序列克隆：以人和牛的Zfy基因序列为参考，分段设计3对引物，采用普通PCR技术扩增，测序，使用DNAMAN软件拼接及分析，首次克隆到长为2247bp的绵羊Zfy基因mRNA的拼接序列。2.根据克隆到的绵羊Zfy基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，针对该基因的编码区设计并合成5对shRNA干扰片段。以pll3.7慢病毒骨架质粒作为载体，构建了5个靶向Zfy基因的shRNA表达载体(A-E)。经过测序证实所构建的5个表达载体含有合成的干扰序列，且调控元件均完整，插入序列的位置均正确。说明这5个shRNA表达载体构建成功，可以用于绵羊Zfy基因的干扰试验。3.将构建好的5个Zfy基因shRNA重组质粒表达载体进行绵羊体外RNAi的研究。屠宰场无菌采回1岁龄绵羊睾丸，采用两步酶消化法分离生精细胞和支持细胞，并进行体外培养。通过转染试剂盒（HET）将构建好的5个Zfy基因shRNA重组质粒表达载体分别转染培养24h后的生精细胞。待36-48小时后转染率达到实验要求，提取细胞总RNA，利用荧光实时定量PCR法检测mRNA的表达水平。初步在细胞水平上筛选出1个干扰效果最好的shRNA重组质粒表达载体A，其使Zfy基因表达水平下降了54%，与对照组相比差异显著（P<0.05）。4.将筛选的Zfy基因shRNA重组表达载体进行绵羊体内RNAi试验。选取2只健康雄性萨福克羊，分别注射重组质粒表达载体，间隔7天注射一次，连续注射2次。最后一次注射7天后，采集精液进行人工授精，结果显示子代绵羊母羔率为54.44%，与正常性别比例差异不显著；试验羊群的受胎率为31.2%，与试验羊场正常受胎率85%相比有明显下降。检测重组质粒表达载体A干扰细胞中Zfx基因的表达水平，发现其表达量降低了44%，与对照组相比差异显著(P<0.05)，表明表达载体A在对Zfy基因产生干扰作用的同时也干扰了Zfx基因，使X、Y精子正常功能的发挥都受到了影响，这可能是导致母羊受胎率下降的主要原因。本实验通过干扰Zfy基因探索了绵羊受精前的性别控制方法，同时也探讨了Zfx/Zfy基因在绵羊精子的发生过程中的作用，为通过沉默Zfy基因控制绵羊后代性别的研究奠定了基础。